Method Article
Это исследование описывает метод, который позволяет быстро и ясно диагностики вирусных заболеваний растений примерно в половине дня с помощью комбинации СВЧ помощь пробоподготовки завод по просвечивающей электронной микроскопии и отрицательные методы окрашивания.
Исследования ультраструктурные изменения, вызванные вирусами часто необходимо четко определить вирусных заболеваний растений. С обычной подготовки образцов для просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) таких исследований может занять несколько дней 1,2 и, следовательно, не подходит для экспресс-диагностики болезней растений вирусом. Микроволновая печь фиксации могут быть использованы резко сократить время подготовки образцов для ПЭМ исследования с похожими ультраструктурным результаты наблюдаются после условно подготовки образцов 3-5. Много различных заказу СВЧ-устройств в настоящее время доступны, которые могут быть использованы для успешной фиксации и вложение биологических образцов для исследования TEM 5-8. В этом исследовании мы демонстрируем по борьбе против табака Вирус мозаики (ВТМ), инфицированные растения Nicotiana аЬасит, что это возможно, чтобы диагностировать ультраструктурные изменения в листьях примерно в половине дня с помощью микроволновой помощью подготовки образца для TEM. Мы выбрали для выполнения этого исследования имеющихся в продаже СВЧ устройств, как он выполняет подготовки образца почти полностью автоматически 5 в отличие от других доступных устройств, где много шагов все равно придется выполнять вручную 6-8 и, следовательно, больше времени и трудоемкий. В качестве подготовки проб выполняется полностью автоматически негативного окрашивания вирусных частиц в соке оставшиеся ВТМ-инфицированных листьев и следующее рассмотрение ультраструктуры и размеры могут быть выполнены во время фиксации и вложения.
Микроволновая печь помощь пробоподготовки
2. Обрезка и секционирования
3. Отрицательные окрашивания
4. Анализ изображений
5. Представитель результаты:
После микроволновой подготовки проб помощью типичных ВТМ-индуцированной ультраструктурные изменения, такие как большие районы, содержащие вирионы расположены параллельно форму можно было наблюдать с просвечивающей электронной микроскопии в цитоплазме зараженных курильщикаЬасит клетки (рис. 1А). Кроме того, в сырой сок ВТМ-инфицированных листьев ВТМ частиц можно было наблюдать, как извилистые, палочковидные структуры после негативного окрашивания (рис. 1б). Анализ изображений из 100 вирусных частиц показал средний размер для ВТМ из 280 нм в длину и в ширину 17nm (рис. 2). Ультраструктуры ВТМ-инфицированных клеток и размер вирионов, наблюдавшиеся в этом исследовании было установлено, что в соответствии с ВТМ-индуцированной ультраструктурным свойства табака и диапазон размеров частиц ВТМ ранее сообщалось в литературе 9-15.
Рисунок 1. Просвечивающей электронной микроскопии ВТМ-инфицированных клеток листьев и вирионов. А) На рисунке показан ультраструктуры ВТМ-инфицированных мезофилла листьев клетки Nicotiana аЬасит после микроволновой подготовки проб помощью растений. Обратите внимание на большой площади параллельно соответствие вирионов, которые накапливаются в цитозоле.C = хлоропластов с крахмалом (St), M = митохондрии, N = ядро, V = вакуоль, Bar = 2 мкм. B) изображения показывает, вирионы которых были обнаружены негативного окрашивания в соке пораженных листьев.
Рисунок 2. Относительный размер вирионов. Относительное распределение длины и ширины ВТМ-частиц после негативного окрашивания сока зараженные листья, как они появились в электронный микроскоп. Средние значения (средняя длина / ширина ± стандартное отклонение) были рассчитаны от 100 вирионов.
Микроволновая печь помощью подготовки образца установки для TEM было доказано на поставку быстрый и надежный ультраструктурным данных в течение нескольких часов 3,4,16. Тонких структурных сохранение органелл и мембран достигается с методом, использованным в данном исследовании была похожа на обычные и cryofixed образцы 5,15 с преимуществом массовые сокращения в образце фиксации и вложения времени от 3 дней или дольше 2 часов. Это представляет собой самый быстрый протокол подготовки образцов для ПЭМ в настоящее время в литературе. Метод, описанный в данном исследовании в сочетании микроволновой подготовки проб помощью установки для TEM с отрицательным методы окрашивания, который позволил четко и быстрой идентификации ВТМ-индуцированной ультраструктурные изменения и вирусных агентов себя. ВТМ, индуцированной ультраструктурные изменения могут быть исследованы после обрезки, секционирования и после окрашивания в течение 4 часов после начала фиксации в передаче электроновэлектронного микроскопа. Использование полностью автоматическом режиме подготовки образца освободил исследователя для проведения негативного окрашивания в промежуточный для того, чтобы определить размер и ширину вирусного агента. Таким образом, мы можем заключить, что этот метод позволяет четко и экспресс-диагностики вирусных заболеваний растений примерно в половине дня, который имеет большое значение для будущего использования в сельском хозяйстве и научных экспериментов на заводе фитопатологии. Поскольку этот метод также может быть использован для экспресс-диагностики человека и животных заболеваний она имеет большой потенциал для будущего применения в медицинской и ветеринарной патологии.
Нет конфликта интересов объявлены.
Эта работа была поддержана Австрийским научным фондом (FWF, P20619 и P22988 для BZ).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Название реагента / оборудования | Компания | Номер в каталоге | Комментарии |
Глутаральдегид | Агар Научно ООО | R1312 | |
Осмия | Агар Научно ООО | R1022 | |
Агар 100 смолы | Агар Научно ООО | R1043 | |
Додеценил ангидрида янтарной кислоты | Агар Научно ООО | R1051 | |
Метил nadic ангидрида | Агар Научно ООО | R1081 | |
Benzyl диметиламин | Агар Научно ООО | R1060 | |
Цитратом свинца | Агар Научно ООО | R1210 | |
Уранилацетата | Агар Научно ООО | R1260A | |
Фосфорно-вольфрамовой кислоты | Агар Научно ООО | R1213 | |
Формвар | Агар Научно ООО | R1202 | |
Leica EM AMW | Leica Microsystems | ||
Leica (Reichert) Ultratrim | Leica Microsystems | Новые модели доступны | |
Leica (Reichert) Ultracut S | Leica Microsystems | Новые модели доступны | |
Diatome Ultra 45 | Gröpl | ||
Philips CM10 TEM | FEI (бывший Philips) | Новые модели доступны | |
Сотовые D | Olympus Инк | ||
Optimas 6.5.1 | Медиа Инк кибернетики | Новая версия доступна |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены