Изучение, зависящими от возраста геномной нестабильности использованием С. CEREVISIAE Хронологические Модель продолжительность жизни

Резюме

Здесь мы опишем набор мутации ДНК анализов, которые могут быть объединены с жизнью дрожжей хронологический промежуток модель для изучения генов / путей, которые регулируют или способствовать нестабильности генома ДНК в процессе старения.

Аннотация

Исследования с использованием CEREVISIAE Saccharomyces старения модель обнаружили жизни регулирующих способов, которые частично сохраняются у высших эукариот ^1-2. Простота и сила дрожжей старения модель может также изучить, в исследовании повреждения ДНК и генома обслуживания, а также их вклад в заболевания в процессе старения. Здесь мы описываем системы для изучения возрастных мутаций ДНК, в том числе базы замены, сдвига рамки мутации, валовой хромосомных перестроек, и гомологичные / homeologous рекомбинации, а также ядерной деятельности репарации ДНК путем объединения жизни дрожжей хронологический промежуток с простыми ДНК повреждения и мутации анализов. Методы, описанные здесь, должны способствовать выявлению генов / путей, которые регулируют геномной нестабильности и механизмов, лежащих в основе возрастных мутаций ДНК и рак у млекопитающих.

протокол

Две жизни модели используются для изучения старения в С. CEREVISIAE: РЛС и CLS. Репликативной (начинающие) срок службы (РЛС) основана на наблюдении, что дрожжевые клетки матери проходят конечное число делений ^3-6. Мы сосредоточимся на хронологический срок службы (CLS), модель, основанная на хронологическом выживания без деления дрожжей в культуре или по тарелкам ^7-11. Дикие дрожжи типа растет в геометрической прогрессии в течение 10-12 часов в синтетических декстрозы полной (SDC) среде . Когда уровень глюкозы снижается, дрожжи переключается из ферментации дыхание, процесс, который называют diauxic смену. Клетки продолжают делиться медленно во время пост-diauxic фазы в течение примерно 48 часов перед входом G ₀ ареста. Уровень метаболизма клеток остается высоким до дня 5-6 (день 0 является прививка день). Жизнеспособность клеток с течением времени могут быть доступны процент хронологически старения клеток, пробы каждые два дня, которые могут выйти G ₀ ареста и образовывать колонии на богатых YPED пластин.

1. Дрожжи хронологический срок службы (CLS) в культуральной жидкости

1. Привить одной колонии в 1 мл синтетического полной среде глюкозу (SDC, таблица 1) и инкубировать в течение ночи при встряхивании (220 оборотов в минуту) при температуре 30 ° C. Три inoculums от независимых колоний должны быть подготовлены для каждого штамма обеспечить биологическую реплик.
2. Развести ночной культуры в свежую среду SDC (обычно 10 мл), OD = 0,05-0,1 (~ 1:100 разведение) и инкубировать при встряхивании (220 оборотов в минуту) при температуре 30 ° C. На этот раз точка считается день 0 хронологического старения. Поддерживать соотношении 1:5 культуры / колбы объемом (10 мл культуры в 50 мл, или на более длительный / большие эксперименты 25 мл культуры в 125 мл) для обеспечения надлежащей вентиляции.
3. Начиная с 3-й день, удалить 2 аликвоты 10 мкл из колбы, развести 10000 раз в автоклаве воды, 10 мкл разведенного культуры (т. е. 10 ⁴ -10) на YEPD (1% дрожжевой экстракт, 2% Бакто пептон, 2% раствором декстрозы , 2% агара), плиты, и инкубировать при 30 ° С в течение 48-72 часов до колониеобразующих объединиться (CFU) учитывается.
4. День 3 КОЕ считается 100% выживаемости. Разведение факторов старения культуры в последующие дни должны быть соответствующим образом скорректированы для обеспечения ~ 20-100 колоний в анализе КОЕ (например, 10 ⁴ -10, 10 ⁴ -30, 10 ³ -10 и др.). Для дикого типа в клетки DBY746 фон, CLS достигает 1% выживаемости около 11-й день.

Вариации на месте анализа жизнеспособности включают в себя:

• Ограничение калорий (CR) глюкозой ограничений. Разбавление ночной культуры в среде глюкозы ограниченной SC (например, 0,5 или 0,05% вместо стандартных 2% глюкозы) в целом приводит к снижению плотности населения насыщения на 3 день, но значительно расширена средняя и максимальная (10% выживаемости) срок службы ^12.
• Для экстремальных CR / голода, мыть день 3 стационарных культуры фазы (как правило, 10 мл, как в шаге 3 выше) с автоклавного воды (ресуспендирования клеток равным объемом воды и спин вниз на 2500 оборотов в минуту в течение 5 минут, повторите 3 раза). Incubationof клетки в воде имитирует голода условии, что дрожжи могут столкнуться в дикой природе. Каждые два дня впоследствии, старение культуры должны быть промыты водой автоклавного и ресуспендировали в равном объеме воды, чтобы удалить какой-либо питательных веществ, освобождается от отмерших клеток лизируется. Выполнить анализ жизнеспособности путем отбора проб старения культуры, как описано выше. Это условие будет голод привели к почти удвоению среднего CLS с диким типом DBY746 штамма ^12.

2. На месте анализа жизнеспособности

В жидкой культуре, малая доля выживших клеток могут вновь вошел в клеточный цикл и расти используя оставшиеся питательные вещества, или те, освобождается от отмерших клеток лизируется в среде, называется фенотипом отрастания / задыхаясь ^13. Мы разработали жизнеспособность-на-пластина системы, которая использует auxotrophy из DBY746 деформации (TRP1), чтобы обойти отрастания / задыхаясь задачи, а также позволяют тестирование эффект постоянного воздействия или лишение различных внешних питательных веществ или стимулов на дрожжах CLS ^11. Это, в месте анализа жизнеспособности также имитирует модель репликативной продолжительности жизни, что клетки постоянно подвергаются обильным питательных веществ в течение всего срока анализа продолжительности жизни.

1. Привить одной колонии в 1 мл синтетического полной среде глюкозу (SDC) и инкубировать в течение ночи при встряхивании (220 оборотов в минуту) при температуре 30 ° C. По меньшей мере три inoculums от независимых колоний должны быть подготовлены для каждого штамма обеспечить биологическую реплик.
2. Давайте культуры вырастет до ~ 10 ⁸ кл / мл (OD ₆₀₀ = ~ 10), развести culturewith автоклавного воды до 100-200 cell/10 мкл (обычно 10 ^{4-кратное} разбавление) и 1000 cells/10 мкл (10 ³ -кратного разбавления).
3. Пластина две аликвоты 10-30 мкл разведенной культуры на одной пластине триптофан отсева SDC. ДляГ каждого штамма, подготовить набор из 8 до 20 пластин и маркированы в соответствии с плотностью покрытия (например, 10 ^{в 4} раза разбавленным, пластины 10 мкл или 10 ⁴ -10, 10 ⁴ -30, 10 ³ -10, 10 ³ -30 и т.д.), которые обеспечивают 10-100 колоний можно пересчитать в ожидании снижения жизнеспособности в процессе старения.
4. Инкубируйте пластина установлена ​​на уровне 30 ° С в течение всего срока анализа продолжительности жизни.
5. В день посева и каждые 2 дня, затем удалить одну пластину и по каплям добавляют 0,5 мл Триптофан (2 мг / мл), чтобы жизнеспособные клетки расти. Инкубируйте планшет при 30 ° С в течение дополнительных 48-72 часов. Граф КОЕ на жизнеспособность в день того триптофан. КОЕ в день покрытие считается 100% выживаемости.

Вариации на месте анализа жизнеспособности включают в себя:

• Возраст клеток на агар пластин (экстремальных условиях голода). Добавить 1 мл 2 раза YPED вместо триптофана в последующие дни, чтобы рост и КОЕ счет ^14.
• Возраст клеток на пластинах с триптофаном отсева синтетических полной среде с различными источниками углерода, например, различные концентрации глюкозы (ограничение калорий глюкозой ограничения), различные источники углерода, такие как этанол, глицерин, уксусную кислоту ^14. Добавьте 1 мл глюкозы / триптофан раствор (20% глюкозы и 1mg/ml триптофан), чтобы рост и КОЕ считается.
• Другие питательные манипуляции, такие как азот.

3. Повреждение ДНК и частоты мутаций в хронологическом старения

Canavanine сопротивления (Может ^г) и секвенирования can1
Спонтанная частота мутаций может быть оценена путем измерения частоты canavanine сопротивления (Может ^г) в хронологическом старения культур. Мутации в CAN1 (YEL063) гена, который кодирует плазма аргинина permease, оказывают клетки устойчивыми к аргинин аналог L-canavanine.Can ^т колонии собраны в различные моменты времени могут быть сохранены для извлечения геномной ДНК и последующего секвенирования CAN1 ген, который может обеспечить мутации спектр данных (с Мутация Surveyor, SoftGenetics).

База замен (Trp ⁺ реверсия)

Штаммы с TRP1-289 содержат мутацию янтаря (C403T) в TRP1 кодирующей последовательности. Измерение частоты TRP1-289 для Trp ⁺ возврат ¹⁵ позволяет оценить базовую ставку замены в течение дрожжей старения хронологическом порядке.

Каркасно-сдвиг мутации

Lys ^- штамм EH150 (Мата, lys2ΔBglII, TRP1-Δ, his3-Δ200, URA3-52, ade2-1o) гаваней lys2ΔBgl мутации II, который был построен, вставив 4 нуклеотидов создать ограничение Bgl II фермента сайта в LYS2 гена . В результате +4 сдвиг в открытой рамки считывания результатов в auxotrophy для лизина, которые могут быть отменены небольшие вставки / удаления мутации ^16-17.

Валовой хромосомных перестроек (ГКЛ)

Для определения валового хромосомных перестроек (ГКЛ), мы получили мутантный штамм, в котором HXT13 (YEL069), кодирование высоко избыточные гексоз транспортер, была нарушена URA3 кассеты ^18. HXT13 находится 7,5 кб теломерных к CAN1 на хромосоме В. Мутации в обоих CAN1 и URA3 генов клетки оказывают сопротивление L-canavanine и 5-fluoroorotic кислоты (5FOA), соответственно. Учитывая низкую частоту точечные мутации, которые происходят в обоих генов, анализ Может 5FOA ^{т т} частоты обеспечивает оценку ГКЛ, что приведет к потере обоих генов.

Гомологичные и homeologous рекомбинации

Для контроля уровня гомологичных (100%) и homeologous рекомбинации (91%) в течение хронологического старения, мы получили мутанты, в которых линеаризованной плазмиды (HIS3:: интрон-ИК-URA3), несущих 100% гомологичными инвертированные повторы (IRS) (pSR406 ) или 91% homeologous IRS (pSR407) на HIS3 локус ^19. Рекомбинация между НП позволяет выразить функциональный белок His3.

1. Параллельно с нормальным анализа жизнеспособности (как описано выше), удалить соответствующее количество клеток от старения культуры,
   1. для мутации Может ^г, начинаются с ~ 2х10 ^{7 клеток} (200 мкл 3-й день культуры);
   2. для возврата Trp ^+, начните с ~ 10 ^{8 клеток} (500-1000 мкл 3-й день культуры);
   3. для Lys ⁺ сдвига рамки мутации, начните с ~ 10 ^{8 клеток} (500-1000 мкл 3-й день культуры);
   4. для ГКЛ, начните с 2-3х10 ^{8 клеток} (2-3 мл 3-й день культуры);
   5. для гомологичной рекомбинации и homeologous, начните с & тильда; 5х10 ^{7 клеток} (200-500 мкл 3-й день культуры);
   настроить покрытие суммы по снижению общего жизнеспособность и увеличение частоты мутаций в хронологическом старения (табл. 2). В случае штаммов с hypermutator фенотип (например, с недостатками в репарации ДНК), уменьшить количество выборки соответственно.
2. Гранул клеток с настольная машина центрифуга (6000 оборотов в минуту в течение 5 мин).
3. Ресуспендируют клеток в 1 мл автоклавного воды и гранул клетки снова.
4. Ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл воды. Пластина клетки,
   1. Может для ^т мутации, на аргинин-отсева синтетических полный пластин среды (SDC-Arg, дополненной 60 мкг / мл L-canavanine сульфата);
   2. для возврата Trp ^+, на триптофан-отсева пластин (SDC-Trp);
   3. для Lys ⁺ сдвига рамки мутация, по лизин-отсева пластин (SDC-Lys);
   4. для ГКЛ, на аргинин-отсева пластин (SDC-Arg) с добавлением 5FOA (1 мг / мл) и L-canavanine сульфата (60 мкг / мл);
   5. для гомологичной рекомбинации и homeologous, на гистидин-отсева пластин дополнен галактозы (2%).
5. Граф CFUs после инкубации 3-4 дней при температуре 30 ° C. Частота мутаций нормирована на количество жизнеспособных клеток.

В дополнение к на месте анализа жизнеспособности, возраст-зависимых Trp ⁺ реверсии, Lys ⁺ сдвига рамки мутации, рекомбинации, или Может ^г может быть исследована в клетках, в возрасте от пластины.

1. Пластина клеток (~ 10 ⁸ клеток / пластину) на Trp-, Lys-Его-отсева, или L-canavanine синтетических полный пластин среды (как описано выше).
2. Каждые два дня (или в момент достопримечательность), оценка вновь возникающих колоний.
3. Мутация частота оценивается нормализации вновь возникающих колонии общего числа жизнеспособных клеток определенный день.

4. Translesion синтеза (TLS)

Возраст-зависимых частоты мутаций может привести к увеличению увеличился макромолекулы повреждений, уменьшилось сотовой защиты / восстановления и увеличения ошибочной репарации ДНК (например, Polζ-зависимый синтез translesion, TLS) в процессе старения. Например, долгоживущие sch9 Δ мутантов выставку повышенную экспрессию SOD2, а также снижение экспрессии ошибок репарации ДНК фермент rev1 ^20. Здесь мы опишем анализ сочетания повреждений ДНК-матрицы и весь ядерный экстракт оценить TLS в пробирке.

1. Подготовка ядерный экстракт, как описано Ван и др. ^21;. Количественно концентрации белка по BCA анализа (Pierce).
2. Добавить 0, 5, 10 или 20 мкг ядерных экстрактов до 50 мкл (конечный объем) реакции содержащие TLS буфера (20 мМ HEPES, 7 мМ MgCl _2, 1 мМ DTT, 25 мМ NaCl, рН 7,8), 200 μMdNTPs и 100 нм ^5'-32 P-меченых 12-Мер праймера (5'-CGA TGG TAC GGA-3 ') отожженного до 48-Мер шаблон, содержащий повреждение ДНК, представляющие интерес (5'-TCG ATA КТГ GTA CTA ATG ATT AAC GAC ТХА AGC ACG TCC GTA ОСО TCG-3 », в которой X является поврежденный участок, например, abasic сайт, 8-оксо-G и т.д.).
3. Выдержите смесь при температуре 30 ° С в течение 30 мин, прекратить реакции с добавлением 2,5 мкл ЭДТА (20 мм) и 2 мкл протеиназы К (10 мг / мл).
4. Purify ДНК с фенолом добычи и осаждением этанолом.
5. Ресуспендируют ДНК в 50 мкл буфера загрузки гель (98% формамида, 20 мМ ЭДТА, и краситель).
6. Решение translesion продуктов синтеза на 19% гель полиакриламида.
7. Количественная TLS использованием phosphorimaging (рис. 1).

5. Представитель Результаты

Мы обычно используется КОЕ рассчитывает на 3-й день, как на 100 процентов выживания в стандартных анализа жидкостей CLS. Процент выживания в последующие дни могут быть установлены для расчета среднего (50% выживаемости) и максимальный (10% выживаемости) продолжительность жизни ^12. Продолжительность жизни результаты, полученные на месте анализа жизнеспособности в целом согласуются с тех, кто использует жидкий анализа CLS, но с уменьшенной средней продолжительности жизни, что связано отчасти с тем, что клетки постоянно подвергаются питательные вещества. Наличие глюкозы ингибирует активность клеточных защиты, как показал на снижение трансактивацию стрессовую реакцию транскрипционных факторов, таких как Msn2 / 4 и Gis1 ^12.

Зависящими от возраста частота мутаций сильно варьируется в зависимости от штамма фон, генетические манипуляции, условия культивирования и возраста. В таблице 2 приведены типичные результаты, полученные в штамма дикого типа (DBY746).

Компонент	г / л
D-глюкозы	20
Сульфат аммония	5
Азот базы (-AS/-AA)	1,8
NaH2PO4	1,4
	мг / л
Аденин	80
L-аргинин	40
L-Аспарагиновая кислота	100
L-глутаминовая кислота	100
L-Гистидин	80
L-изолейцин	60
L-лейцин	120
L-лизин	60
L-метионина	80
L-фенилаланин	60
L-серин	400
L-Треонин	200
L-триптофан	80
L-тирозин	40
L-валин	150
Урацил	80

Таблица 1. Синтетический полной среде глюкозы, SDC (приспособиться к рН 6,0 с NaOH). 4-кратное превышение гистидин, лейцин, триптофан и урацил включены, чтобы компенсировать auxotrophy из DBY746 напряжения.

	День 3 (среднее ± SEM)	До (при старении)
Может т	1,76 ± 0,12 x10 -6	6-8 х10 -6
Trp + возврат	6,60 ± 1,70 х10 -8	1,60 х10 -6
Lys + сдвига рамки мутации	3,00 ± 0,78 х10 -8	0,70 х10 -6
ГКЛ	0,62 ± 0,10 х10 -8	0,30 х10 -6
Гомологичной рекомбинации	5,55 ± 2,74 x10 -6	27,00 х10 -6
Homeologous рекомбинации	0,12 ± 0,04 x10 -6	0,48 х10 -6

Таблица 2. Типичные частоты мутаций клетки дикого типа (DBY746) в течение хронологического старения.

Рисунок 1. Результаты translesion синтеза (TLS) ^20. Ядерные экстракты из 3 дневных стационарной фазы дикого типа (DBY746) и sch9 Δ мутантных клеток инкубировали с неповрежденными или abasic сайт-шаблоны, содержащие ДНК в течение 30 мин при 30 ° С. TLS продуктов обозначены твердые (с неповрежденными шаблон) или пунктирными (с поврежденной шаблон) линий. Существовал не translesion синтез наблюдается в ядерных выписка из sch9 мутантов Δ. Бесплатный грунтовки обозначены открытые стрелки.

Обсуждение

Жидкие старения культур нибудь выставку отрастания / задыхаясь фенотипа ^13, что затрудняет анализ CLS. Восстановление обычно происходит, когда более чем 90-99% населения утратила жизнеспособность. Этот фенотип часто ассоциируется с повышенным окислительным стрессом и / или уменьшить защиты в клетке. Например, частота этого фенотипа более чем вдвое в клетках не хватает цитозольного супероксиддисмутазы и значительно снижает в долгоживущих мутантов (например, sch9 Δ или RAS2 Δ) или мутанты гиперэкспрессией супероксид дисмутазы ^22. На практике мы определяем отрастания как увеличение рентабельности или стабилизации в жизнеспособность в течение 3 последовательных выборок в фазе высокого смертности в хронологическом старения.

Возраст-зависимые частот различных мутаций ДНК сильно варьироваться в зависимости от штамма фон, генетические манипуляции, условия культивирования, а также возобновление роста / задыхаясь и крайне низкой выживаемости. Предварительно эксперименты должны проводиться во время такие пункты, как среднее и максимальное выживание с различной плотностью покрытия для мутации анализы, чтобы определить диапазон частоты мутаций, прежде чем performingthe полный анализ жизни масштабе. Дикого типа всегда должны быть включены в продолжительности жизни или учебы частоты мутаций параллельно какое-либо лечение или генетических мутантов, например, что между эксперимента-вариации могут быть учтены. Множественные биологические реплики должны быть включены в исследование, и, как жидких, так и на местах жизнеспособность / мутация анализы должны проводиться для подтверждения результатов.

Вместо того чтобы сосредоточиться на одном конкретном типе мутации ДНК, профилирование возрастной нестабильности генома с помощью нескольких тестов в комбинации, может пролить свет на конкретные повреждения ДНК и повреждение ДНК ремонт системы (систем), которые способствуют возрастные геномной нестабильности. Например, значительное увеличение валового хромосомных перестроек (ГКЛ), по сравнению с теми других мутаций ДНК, наблюдается в дикие дрожжи типа предлагая elevationof двойным разрывом нити и / или обесценения в негомологичными конце соединения (NHEJ) во время дрожжи хронологического старения (табл. 2). Can1 спектр мутаций (секвенирование гена CAN1), полученные в дикого типа старения дрожжей предложил увеличение окислительного повреждения во время хронологическое старение и ошибок репарации ДНК, тогда как в долгоживущих мутантов sch9 Δ, менее окислительных повреждений ДНК и значительно уменьшается ошибок translesion синтеза наблюдались ^20.

Методы, описанные здесь могут быть дополнительно расходуется для изучения возрастных геномной нестабильности. Например, покоя и не покоящихся клеток может быть выделен из дрожжей стационарной фазы культур методом градиента плотности описывается Алленом и соавт. ^23. В сочетании с мутацией анализы, описанные здесь, мы уже сообщали, что большая часть возрастных мутаций возникает из покоя клетки, а не делиться, повреждены или апоптоза клеток ^20,24.