Immunohistochemistry: Парафин частей с помощью Vectastain ABC Kit Векторные Labs

Резюме

Аннотация

Иммуногистохимии (IHC) является ценным техника используется для локализации / визуализации экспрессии белка установлен срез ткани с использованием специфических антител. Есть два метода: прямой и косвенный метод. В этом эксперименте мы будем только описывают использование косвенных окрашивания IHC. Косвенные окрашивания IHC использует весьма специфический первичный и биотин, конъюгированных вторичных антител. Первичные антитела используются для дискретно идентифицировать белки интереса путем связывания с конкретным эпитопом, а вторичные антитела вычесть для неспецифического фона окрашивания и усиливать сигнал, образуя комплексы с первичным антителом. Слайды могут быть либо генерируется из замороженных срезах, или парафин разделы монтируются на стеклах. В этом протоколе, мы обсудим подготовку парафин разделы по депарафинизации, гидратация использованием алкоголя градиент, тепло-индуцированной поиска антигена, и блокирования эндогенной активности пероксидазы и неспецифического связывания объектов. Некоторые разделы затем окрашивали антителами, специфичными для Т-клеток CD8 маркеров и в то время как другие окрашивают в течение тирозингидроксилазы. Слайды впоследствии лечат вторичных антител, конъюгированных с биотином, то разработаны с использованием авидин конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP) с Diaminiobenzidine (DAB) в качестве субстрата. После развития, слайды контрастно для контраста, и монтировать под покровные с permount. После адекватной сушки, эти слайды готово для работы с изображениями.

протокол

Окраска парафиновых срезов

1. DEWAX слайды с Ксилол (Fisher X3 ^S -4) 3 раза в течение 5 минут каждый (изменение ксилола каждый месяц в зависимости от использования, ксилол является токсичным). Используйте посуду и обложки для 20 слайдов с Фишером реф 08-812-1A и стойки сделаны с учетом этих блюд. 200 мл жидкости за блюдо.
2. Гидратов через алкоголь градиент следующим образом (изменение градиента каждые 2 недели):
   • 2x в 100% этанола (Fisher # A406-20) в течение 2 минут каждый
   • 2x в 95% этилового спирта в течение 2 минут каждый
   • 1x в 70% этилового спирта в течение 2 мин
   • 1x в 50% этилового спирта в течение 2 мин
   • 1x в 30% этилового спирта в течение 2 мин
   • 1x DDH ₂ O в течение 2 мин
3. Замочите в DPBS в течение 5 мин (DPBS = изменение фосфат Дульбеко буферным раствором с Са ^{2 +} и Mg ^{2 +).}

Антиген восстановления:

1. Разогреть Na-цитрат буфера (10 мМ, рН 6,5) в микроволновой печи.
2. Кук слайды в течение 15 мин в микроволновой печи. Слайды никогда не должна пересыхать так что проверить каждую мин и добавляют Na-цитрат в случае необходимости.
3. Дайте остыть при комнатной температуре.
4. Блок эндогенной активности пероксидазы с 1% H ₂ O ₂ в DPBS в течение 20 мин (1,5 мл 30% акций Sigma H-1009 в 50 DPBS мл).
5. Замочите в DPBS 3 х 5 мин.
6. Блок неспецифических сайтов путем инкубации в течение ночи при +4 ° С в DPBS + 5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) + 0,1% азида Na + 5% сыворотки.
   
   Примечание: Выбор сыворотки будет зависеть от вида, в которых антитела используются для окрашивания были сделаны. Блок с сывороткой видов, в которых вторичные Ab (конъюгированные с биотином) было сделано. Если этого нет, используйте сыворотки от вида отличается от той, в которой основной Ab было сделано.
   
   
7. Блок биотин сайты с авидин / биотин блокирующий комплект (Vector лабораторий Каталог # SP-2001):
   • Инкубируйте с авидин D в течение 15 мин. Промыть кратко DPBS.
   • Инкубируйте с решением биотина в течение 15 мин.
8. Инкубируйте в начальной Ab в течение 2 часов при комнатной температуре, в DPBS + 2% BSA + 0,1% NaAzide + 2% сыворотки (то же, для блокировки шаг).
9. Замочите в PBS 3 х 5 мин.
10. Инкубируйте с вторичным Ab сопряженных с биотином в течение 1 часа при комнатной температуре в DPBS + 2% BSA + 0,1% азида Na + 2% сыворотки (то же, используются для блокировки шаг).
11. Подготовка ABC реагента в то же время, поскольку он должен развиваться, по крайней мере 30 минут перед использованием! (См. материалы)
12. Подготовка в 50 мл коническую трубку. В 15 DPBS мл (без сыворотки, не азид) добавить 3 капли реагента, перемешать и добавить 3 капли реагента B и перемешать. Не следует помещать бутылки, а ждать капли сформировать самостоятельно. ABC комплект Vectastain PK-6100 от векторного Labs.
13. Замочите в DPBS 3 х 5 мин.
14. Инкубируйте с реагентом ABC в течение 30-45 минут при комнатной температуре.
15. Замочите в DPBS 3 х 5 мин.
16. Подготовка субстрата пероксидазы DAB (Vector Labs # SK-4100) в 5 мл DDH ₂ O в стеклянном флаконе непосредственно перед использованием (см. материалы)
    • 2 капли буферного раствора акции, перемешать
    • 4 капли DAB, смеси (должен стать чуть-коричневый)
    • 2 капли Н ₂ О _2, перемешать
17. Оставьте DAB подложки, на вершине горки и следить за коричневой окраски.
18. Dip слайды в лед + водопроводную воду, чтобы остановить реакцию.
19. Промыть под холодной водопроводной водой в течение 5 мин.
20. Контрастирующая с гематоксилин (20 сек; Фишер CS401-D) и промыть в проточной воде, пока вода не выходит ясно.
21. Дегидрировать через алкоголь градиент, начиная с 30% этанолом до 100% этилового спирта (2 мин каждый).
22. Замочите в ксилоле 3 х 5 мин.
23. Установить при помощи Permount (Fisher # SP15-100): поставить некоторые выше раздел о слайда и нажмите медленно на секции с покровным без пузырьков воздуха. Не перемещайте покровное до полного высыхания, которое занимает ~ 24 часов.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Xylene	Fisher Scientific	X3S-4	Change xylene every month depending on use. Xylene is TOXIC.
100% ethanol	Fisher Scientific	A406-20	Use to make EtOH gradient.
DPBS			Dulbecco’s modified Phosphate Buffered Saline WITH Ca2+ and Mg2+
Na-Citrate buffer			10 mM, pH 6.5
H2O2	Sigma-Aldrich	H-1009	30% stock => Dilute to 1% in DPBS
Blocking solution			DPBS + 5% bovine serum albumin (BSA) + 0.1% Na Azide + 5% serum.
BSA
Sodium Azide			NaAzide
avidin/biotin blocking kit	Vector Laboratories	SP-2001
Ab buffer			DPBS + 2% BSA + 0.1% Na Azide + 2% serum (same as used for the blocking step)
ABC kit Vectastain PK-6100	Vector Laboratories
DAB peroxidase substrate	Vector Laboratories	SK-4100
ddH2O
Hematoxylin	Fisher Scientific	CS401-D	counterstain
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Slides and cover-slips			glass