Изображений G-белком рецептор (GPCR)-опосредованной сигнализации События, управления хемотаксис Dictyostelium Discoideum</em

Резюме

Здесь мы описываем подробные изображения живой клетки методы исследования хемотаксиса. Мы представляем флуоресценции микроскопических методов контроля пространственно-временной динамике сигнальных событий в мигрирующих клетках. Измерение сигнальных событий позволяет нам понять, как дальше GPCR-сети сигнализации достигает градиент зондирования хемоаттрактантов и контролирует направленного миграции эукариотических клеток.

Аннотация

Многие эукариотических клетках может обнаружить градиенты химических сигналов в своей среде и мигрировать соответственно ^1. Это руководствоваться миграции клеток называется как хемотаксис, что очень важно для различных клеток для выполнения своих функций, таких как торговля иммунных клеток и структурирование нервных клеток ^{2, 3.} Большое семейство G-белком рецепторы (GPCR) обнаруживает переменную небольшие пептиды, известные как хемокины, направить миграции клеток в естественных условиях ^4. Конечной целью исследования хемотаксиса чтобы понять, как машины GPCR чувств хемокинов градиенты и контроля сигнализации событий, приведших к хемотаксис. С этой целью мы используем методы визуализации для мониторинга в режиме реального времени, пространственно-временной концентрации хемоаттрактантов, сотовые движения в градиенте хемоаттрактант, GPCR опосредованной активации гетеротримерные G-белком, и внутриклеточных сигнальных событий, участвующих в хемотаксис клеток эукариот ^5-8 . Простой эукариотических организмов, Dictyostelium discoideum, отображает chemotaxic поведения, которые аналогичны тем, лейкоцитов и D. discoideum является ключевым модельной системой для изучения эукариотических хемотаксис. Как свободно живущих амеб, Д. discoideum клетки делятся в богатой среде. После голода, клетки вступают программа развития, в котором они совокупный через цАМФ-опосредованной хемотаксис сформировать multicullular структур. Многие компоненты, участвующие в хемотаксис в лагерь были определены в D. discoideum. Связывание цАМФ с GPCR (car1) индуцирует диссоциации гетеротримерные G-белков в Gγ и Gβγ подразделения ^{7, 9, 10.} Gβγ подразделения активировать Ras, который, в свою очередь, активирует PI3K, превращая PIP PIP ₂ в ₃ на клеточной мембране ^11-13. PIP ₃ служат сайты связывания белков с pleckstrin Гомология (PH) доменов, таким образом, набор этих белков с мембраной, ^{14, 15.} Активация рецепторов car1 также контролирует мембраны объединений PTEN, который dephosphorylates PIP PIP ₃ до ₂ ^{16, 17.} Молекулярные механизмы эволюционно консервативных в хемокинов GPCR-опосредованной хемотаксис клеток человека, такие как нейтрофилы ^18. Мы представляем следующие методы исследования хемотаксиса D. discoideum клеток. 1. Подготовка хемотаксиса клетки компонента. 2. Изображений хемотаксис клеток в цАМФ градиента. 3. Мониторинг GPCR индуцированной активации гетеротримерные G-белка в одном живых клеток. 4. Изображений хемоаттрактант запускаемой динамических PIP ₃ ответов в одном живых клеток в реальном времени. Наши разработанные методы визуализации могут быть применены для изучения хемотаксиса лейкоцитов человека.

протокол

1. Подготовка хемотаксиса компетентные клетки discoideum Dictyostelium

1. Для создания Д. discoideum клетки, которые хемотаксиса к хемоаттрактант цАМФ, урожай клеток, растущих в D3-T мультимедийных от тряски культуры при 22 ° C.
2. Вымойте клетки дважды в непитательных развития буфера (DB буфера, содержащего 5 мМ Na ₂ HPO _4, 5 мМ KH ₂ PO _4, 2 мМ MgCl ₂ и 0,1 мМ CaCl _2).
3. Повторное приостановить клеток в DB буфера при плотности 2х10 ^{7 клеток} / мл.
4. Встряхните 10 мл клеток в 250 мл колбу на 100 оборотов в минуту при 22 ° С в течение одного часа.
5. Доставить по 100 мкл 7,5 фондовом цАМФ мкМ до 10 мл клетки каждые шесть минут в течение 6 часов, чтобы достичь конечной концентрации 75 нМ цАМФ, процесс обозначается как цАМФ пульсирующий лечения. Через 5-6 часа цАМФ пульсирующий лечения, Д. discoideum клетки становятся хемотаксиса компетентных к цАМФ градиента.
6. Сбор клетки центрифугированием при 200 г в течение 5 мин, а затем ресуспендирования клеток с буфера БД, содержащей 2,5 мМ кофеином, и встряхнуть при 200 оборотов в минуту при 22 ° С в течение 20 мин до basolate ячейки хемотаксиса ситуации.

2. Изображений chemotaxing клеток в видимом и манипулировать хемоаттрактант градиент

1. Засыпка микропипетки со свежеприготовленным 30 мкл раствора 1 мкМ цАМФ и Alexa 594 в 0.1μg/μl в буфер DB.
2. Прикрепите к Femtotip микропипетки держателя и подключить трубку к аппарата давление подачи, Эппендорф FemtoJet системы.
3. Прикрепить микропипетки сборки микроманипулятора (Eppendorf TransferMan NK2) моторизованные микроманипулятора обеспечить постоянное давление с целью установления стабильного градиента.
4. Гора одна и LabTek камере, наполненной 6 мл буфера БД более 40х объектив нефти на конфокальной микроскопии и использовать яркие оптики, центр Femtotip в поле зрения.
5. Включите давление питания и установить компенсации давления (PC) на 70 гПа установить градиент цАМФ / Alexa 594 смеси.
6. Визуализируйте цАМФ градиент, мониторинг смесь требуемой концентрации цАМФ и Alexa 594 флуоресценции с помощью возбуждения с лазерной линии 543 нм.
7. Использование автоматического позиционирования функции микроманипулятора поставить микропипетки в желаемых местах и ​​установить их как положение 1, положение 2, и позиция 3 манипулировать градиент к какой ячейке подвергаются.

3. Неподвижный неполяризованного системы клетки облегчает изображений сигнальных событий, участвующих в цАМФ градиент зондирования

1. После кофеином, удалить аликвоту клеток и центрифуге при 500g в течение 3 мин.
2. Удалить буфер и разбавленных клетки до 5х10 ^{5 клеток} / мл свежего буфера БД, содержащей 2,5 мМ кофеина.
3. Нанести 1 мл клеточной суспензии для одного хорошо камере или 0,4 мл в каждую лунку четыре хорошо камере.
4. Разрешить клетки придерживаться в течение 10 мин, тщательно пипетки с буфером для удаления одинокие клетки и заменить с тем же объемом.
5. Найдите нужный клетки под микроскопом и начать съемки.
6. Для эксперимента, предназначенная для контроля динамики сигнализации компонентов в клетках подвергая на устойчивый градиент, лечения клеток с 5,0 мкм (конечная концентрация) Latrunculin В течение 10 мин до начала экспериментов.

4. Одновременный мониторинг гетеротримерные G активация белка и PIP ₃ производства

1. цАМФ пульсирующие клетки разработки совместного выражения и GαCFP YFPGβ (G клеток) и клеток, экспрессирующих PIP ₃ показатель PH-GFP (PH клетки) ^7.
2. Смешайте эти два типа клеток с соотношении 1:1 и пластины их в одной скважины или 4-х и камер.
3. Создание и сохранение выбросов отпечатков пальцев ссылкой кривой CFP, YFP и GFP с помощью лямбда-стека Приобретение режиме в спектральном диапазоне от 464 до 624 нм с шириной 10 нм.
4. Одновременно образ G белка активации в клетках G и PIP ₃ производства в PH клетки, используя при том же режиме стека Приобретение Lambda в спектральном диапазоне от 464 до 544 нм с шагом 10 нм.
5. Применить Линейная функция Unmixing программного обеспечения Zeiss 510META использованием сохранены CFPand YFP и излучение отпечатки пальцев для математически вычислить вклад каждого флуорофора в стек Lambda отделить CFP и YFP интенсивности в отдельных каналов в группе G.
6. С той же стратегии, применяются линейные функции Unmixing использованием GFP сохранены отпечатки пальцев и фонового излучения математически вычислить интенсивность в GFP PH клеток.

5. Представитель результаты:

1. Отличная система модели Д. discoideum для GPCR опосредованной хемотаксис. социальные амебы, Д. discoideum экспонатов поразительно хемотаксис в течение жизненного цикла. Из-за своей генетической и биохимической преимущества, Д. г обеспечивает мощный ыystem для изучения хемотаксиса.
2. Хемотаксис клеток под видимым и манипулировать chemoattract полей. Здесь мы впервые показать простую методологию для получения линейной зависимости между концентрацией цАМФ и интенсивность флуоресцентного красителя Alexa 594 от разбавления серии 2 мкМ цАМФ смешивали с 10 мкг / мл Alexa 594 (рис. 2). Далее, мы предлагаем простой способ визуализировать градиент, кроме того, установить количественные измерения концентрации цАМФ из градиент, интенсивность Alexa 594 (рис. рис. 2B).
3. Сотовые подвижность несвязанных с поляризацией клеток и направленного зондирования. Ингибитор полимеризации актина устраняет уже существующие морфологические полярности, а также предотвращает движения клетки при сохранении клеток возможность направленного зондирования (рис. 3А). Занятость видимых и манипулировать цАМФ стимуляции гарантии ввода, например единообразно применяться стимуляции или градиент. Этот метод позволяет количественного анализа цАМФ-индуцированной перераспределение ключевых компонентов сигнализации в градиенте зондирования техники. Измеренные пространственно-временной динамике этих сигнальных компоненты позволяют нам понять, как сети сигнализации достигается адаптация к единому стимуляции при создании поляризованных биохимических ответы на градиентов (рис. 3б).
4. Системная измерения кинетики chemosensing сети сигнализации при воздействии устойчивый градиент. Чрезвычайно важно для измерения динамики / Кинетика направленного зондирования сигнализации компоненты, чтобы понять, как каждый компонент вносит свой ​​вклад в создание внутриклеточной поляризации, когда клетки опыт первого градиента. Применение живого изображения клетки с высоким темпом пространственное разрешение, покажем сначала, двухфазный PIP3 производства ячейки, которая подвергается постоянным градиентом цАМФ (рис. 4A-C). Применение жить изображений клетки, мы систематически измерять динамику направленности зондирования конкретных сети сигнализации из лагеря стимуляции PIP3 производства (рис. 4, Е).
5. Одновременный мониторинг гетеротримерные белка G активации и PIP ₃ производства по ровным слоем цАМФ стимуляцией. Ферстер резонанс передачи энергии (сокращенно FRET) обеспечивает эффективный подход к мониторингу гетеротримерные белка G активации (диссоциации) на цАМФ стимуляции. Здесь мы описали удобный простой внедрять систему для одновременного измерения гетеротримерные белка G активации и PIP ₃ производства путем мониторинга FRET изменения и мембраны транслокации PIP ₃ зонд, PH-GFP в С и рН клеток соответственно (рис. 5 ). Единообразно применяться цАМФ стимуляция вызывает стойкие белка G в то время как активация которых вызывает переходные PIP ₃ производства.

Рисунок 1: отличная система модели Д. discoideum для хемотаксиса GPCR опосредованной. А. Схема показывает краткую сигнального пути направленного зондирования. Б. цАМФ градиент вызывает быстрое хемотаксис D. discoideum клеток. Клетки выразить PIP ₃ зонд, PH-GFP (зеленый). Градиент (красный) визуализируется Alexa 594. Шкала бар = 50 мкм.

Рисунок 2: хемотаксис клеток под видимым и манипулировать chemoattract полей. А. На графике показана линейная зависимость между концентрацией цАМФ и интенсивность флуоресцентного красителя Alexa 594 от разбавления серии 2 мкМ цАМФ смешивали с 10 мкг / мл Alexa 594. Б. Количественное измерение концентрации цАМФ градиент линейной зависимости концентрации цАМФ и интенсивности флуоресцентного красителя Alexa 594 в A.

Рисунок 3: Сотовый подвижность несвязанных с поляризацией клеток и направленного зондирования. А. На рисунке показано, что неподвижный клеток лечения ингибитора полимеризации актина Latrunculin B поддержания способности направленного зондирования. Клетки выразить PIP ₃ зонд, PH-GFP (зеленый). Градиент (красный) визуализируется Alexa 594. Б. манипулировать цАМФ стимуляции и неподвижные клеточной системы позволяет для решения ключевых вопросов, направленных зондирования. Шкала бар = 10 мкм.

Рисунок 4: Системная измерения кинетики chemosensing сети сигнализации при воздействии устойчивый градиент. А. Монтаж показывает двухфазный PIP ₃ производства (Green) из клетки, которая подвергается постоянным градиентом цАМФ (красный). B. На рисунке показано регионах интересов (трансформирования) для измерения кинетики PIP ₃ продукция, представленная в С. С . Кинетика ое PIP ₃ производства в клетки подвергаются постоянным градиентом. Д. Схема показывает, сети сигнализации направленного зондирования из лагеря стимуляции PIP ₃ производства. Их кинетика при воздействии устойчивый градиент представлена ​​в том же цвете сплошные линии на E.

Рисунок 5: Одновременный мониторинг нескольких событий GPCR сигнализации сетей. А. Схема показывает одновременное измерение гетеротримерные белка G активации и PIP ₃ производства путем мониторинга FRET изменения и мембраны транслокации PIP3 зонд, PH-GFP в С и рН клетки, соответственно. Б. Монтаж изображения радуги G и PH клетки показывает, , что ровным слоем цАМФ стимуляция вызывает стойкие белка активации G на клеточном периферические, в то время, который вызывает переходные PIP3 производства. Время до точки (0s) и после стимуляции 4.9s, и 10.2s 20.4s. С. Кинетика G активация белка и PIP3 производства по ровным слоем цАМФ стимуляции.

Обсуждение

Процессы идущие хемотаксиса компетентных этапе клетки

Для дикого типа D. discoideum клетки, она занимает около 5 ~ 6 часов пульсирующий развития при комнатной температуре, чтобы побудить их в хорошо хемотаксиса компетентных стадию, при которой клетки дисплей хорошо поляри?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
D3-T Медиа роста	К. Д. Медицинские
Кофеин	Сигма
Latrunculin B	Молекулярные зонды
Alexa 594	Молекулярные зонды
цАМФ	Сигма
ChronTrol XT программируемый таймер	ChronTrol Corp
Miniplus 3 перистальтического насоса	Gilbson
Платформа роторном шейкере
FemtoJet микрокапиллярных давление питания	Эппендорф
Одно-и четырех-и Lab-Tek II покровного стекла камеры	Nalge Nunc Международной
LSM 510 META или эквивалент флуоресцентного микроскопа	Zeiss		40X 1,3 НС или 60X 1,4 Н. А. масла ДВС План-Neofluar объектива
Olympus X81 или эквивалент	Олимп		Требуется 100X 1,47 NA TIRF объектив