Структурирование эмбриональных стволовых клеток Использование Био Flip Chip

Резюме

Мы демонстрируем простой метод для размещения клеток в нужное место на подложке. Этот метод модели клетки, щелкая силиконовых чипов содержащие лунки заполнены клеток на подложке. Этот метод обеспечивает новый способ модуляции диффузии и juxtacrine сигналов между клетками.

Аннотация

Межклеточных взаимодействий, состоящий из диффундирующие сигнализации и межклеточных контактов (juxtacrine сигнализации) играют важную роль в многочисленных биологических процессов, таких как рост опухолей, дифференциация стволовых клеток и стволовых клеток самообновлению. Число методов в настоящее время существуют для модуляции клеточной сигнализации в пробирке. Один из методов модуляции общую сумму диффундирующие сигнализация варьировать плотность клеток во время посева культуры. Из-за случайного характера клеточных посева, это приводит к значительному изменению фактического межклеточных расстояние и количество межклеточных контактов и не может предписать местным условиям. Более конкретный подход для режима сигнализации ячейки использовать молекулярные ингибиторы или генетические подходы, чтобы сбить конкретных сигнальных белков, но оба эти методы лучше всего подходят для манипулирования небольшое количество молекул. Здесь мы демонстрируем новый подход к модуляции межклеточной сигнализации, который модулирует локального окружения кластера клеток путем размещения разного числа клеток в нужное место на подложке. Этот метод обеспечивает дополнительный способ управлять местной диффузии и juxtacrine сигналов между клетками. Наш метод позволяет использовать Био Flip Chip (BFC), microfabricated силиконовые чип, содержащий сотни до тысячи лунки, каждый размером провести ни одну ячейку или небольшого числа клеток. Мы загружаем чип с клетками, просто с помощью пипетки их на массиве скважин и стиральные выгружен клетки от массива. Чип затем перевернуть на подложку, в результате чего клетки выходят из колодцев и на подложку, поддерживая их кучность стрельбы. После клетки прилагается, чип может быть удален (или левой далее). Такой подход к ячейке кучность уникален тем, что: 1) не меняет химию подложки, тем самым позволяя клеткам размножаться и мигрировать, 2) позволяет структурирование на любую подложку, в том числе ткани культуры полистирола, стекла, Матригель, и даже фидерных слоев клеток, и 3) совместим с традиционной печати микроконтактной, позволяя создавать внеклеточной матрицы с острова клетки помещаются внутри этих островах. В этом видео, мы демонстрируем структурирование мышиных эмбриональных стволовых клеток на ткани культуры полистирола использованием BFC.

протокол

Создание BFC

BFCs изготавливаются методом литья полидиметилсилоксан (PDMS) над 4 "пластин мастер Si.

Создание мастер пластин

1. Начните с обезвоживания Si пластин в течение 30 мин при температуре 130 ° C.
2. Место пластины на спин-для нанесения покрытий, залить SU8-2050 (Microchem) на пластины, рампа от 300 об / с до 3000-4000 оборотов в минуту, и спина в течение 30 с для получения функция высоты 40-30 мм, соответственно.
3. После спиннинг, место пластины на 65 ° C плитой, немедленно нарастить температуре до 95 ° С в течение 5-6 мин, после чего рампу его до 65 ° C.
4. Expose пластин для УФ дозы 200 мДж / см ² на контакт Aligner использованием темного поля маски.
5. Место пластины на 65 ° C плитой, немедленно нарастить температуре до 95 ° С в течение 4-5 мин, после чего рампу его до 65 ° C.
6. Разработка пластин в ацетат ПМ и изопропанола.
7. Silanize пластин в течение 30 мин с использованием гексаметилдисилоксан (Shin-Etsu MicroSi), или (Tridecafluoro-1 ,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-трихлорсилана (t2492-KG, UCT Специальности, Бристоль, штат Пенсильвания), для предотвращения PDMS от придерживаясь пластины мастер Si.

Молдинг чипов

1. Смешайте PDMS (Dow Corning, Sylgard 184) в соотношении 10:1, залить его на пластину мастер Si (~ 15 г на пластину), и пусть это лекарство в течение ночи при комнатной температуре.
2. Пил вылечить PDMS от пластины кремния и вырезали каждого чипов с помощью лезвия бритвы.
3. Бонд каждый чип 1х1 см вырезать стекло микроскопа для легкой обработки.

Подготовка BFC для использования

1. Замочите на ночь в BFC PBS, чтобы предотвратить поглощение медиа в PDMS в ходе эксперимента.
2. Сухой чипов с Kimwipe (KIMTECH наук).
3. Поместите каплю 7,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) (~ 200 мл) на узорной поверхности BFC, а затем очистить его с пипетки, чтобы разогнать BSA и удалить все пузырьки из скважин.
4. Оставьте на БСА BFC поверхности в течение по крайней мере 0,5 часа. В идеале агитировать BSA каждые 15 мин для предотвращения образования корки.
5. Для установки BFC внутри 35x10 мм блюдо ТКТ (Falcon, 35-3001), вырезать ободах ТКТ на полпути блюдо вниз так, что ¾ "зажимы (Office Depot) будет соответствовать по краю блюда, чтобы зажать чип и блюдо вместе.
6. Вырезать прокладку прокладка (рама формы с 20'20 мм внешнего края, 15'15 мм, внутренний край, и 250-500 мм толщиной) из листа PDMS (Продукты Силиконовые специальности) или любой другой силикон, и применить его на блюде с помощью пинцета.

Структурирование клеток с BFC

1. Стерилизовать блюдо, прокладка, BSA покрытием чип и 2 клипа связующего под ультрафиолетовым светом в течение 1 минуты.
2. Аспирируйте BSA и ополосните BFC в два раза с 200 мл PBS.
3. Добавить желатин, чтобы блюдо ТКТ вырезать если это требуется для мобильного он-лайн. В противном случае, влажный ТКТ поверхность с некоторыми средствами массовой информации, прежде чем применить его к микросхеме (см. ниже). Это позволяет избежать пузырей в камере.
4. После аспирационных PBS, пипеткой 200 мл клеточной решение (~ 1 × 10 ^{6 клеток} / мл) на BFC поверхности. Пусть клетки урегулировать в течение 5-10 мин.
5. Tilt BFC в один из углов на угол ~ 15 ° и медленно пипетки клетка решение прочь с 200 мл пипетки. Затем поместите BFC плоские и добавить 100 мл ФСБ или пустой носитель в противоположный угол BFC. Промыть BFC таким образом дополнительные 2-4 раза, при необходимости, удалить все клетки межскважинном регионах.
6. Внесите 200 мл среды на поверхности чипа. Аспирируйте желатина / СМИ от TCP. Инвертируйте предварительно смачивается блюдо и медленно толкать BFC вверх, в блюдо.
7. Применение связующего клипа каждый, чтобы обе стороны камеры, чтобы запечатать его. Удалите металлические зубцы из зажимы так, чтобы блюдо остается уровень, когда перевернулся.
8. Наконец, быстро переключаться установку как, избегая ненужных движений, и поместить его в инкубатор.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Хотя протокол и видео показано здесь описывать использованием BFC с ¹ по шаблону мышиных эмбриональных стволовых клеток (mESCs), BFCs могут быть использованы для картины практически любой тип клеток, представляющих интерес. Единственное изменение, один, возможно, придется сделать это, чтобы измен?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184
Silicon master mould
Tissue culture dishes	Falcon BD	35-3001	35 mm
3/4" binder clips
PBS
hexamethyldisiloxane	Shin-Etsu MicroSi
New Item	MicroChem Corp.	SU8-2050
PM acetate
Isopropanol
BSA			7.5% Bovine Serum Albumin