Эффективное Вывод прав нейронов и нейронов прародителей из плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека с малыми Индукционная Молекула

Резюме

Мы создали протокол для индукции нейробластов прямо из плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека поддерживается при определенных условиях с малыми молекулами, что позволяет вывод большой запас человеческого нейронов и нейронных прародителей типов клеток в развивающемся ЦНС для нейронных ремонта.

Аннотация

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging^1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells^1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration^1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity^7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic^11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules¹⁴ (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders^{1, 14}. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons^{1, 14, 15}. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

протокол

1. Решение и средства массовой информации подготовки

1. Желатин раствор для нанесения покрытия: 0,1% (вес / объем) желатин в DDH ₂ O, автоклавного и хранить при температуре 4 ° C.
2. Матригель покрытия решений. Маточный раствор: медленное таяние Матригель (10 мл) при температуре 4 ° С в течение ночи, добавьте 10 мл ледяной DMEM или DMEM/F12, хорошо перемешать и аликвоту 1 мл / трубки под капотом стерилизованные культуры ткани, хранить при -20 ° C. Рабочий раствор: медленное таяние 1 мл Матригель аликвоту при 4 ° С в течение 1-2 часов, трансфер в 14 мл охлажденного DMEM или DMEM/F12 и хорошо перемешать под капотом стерилизованные культуры ткани непосредственно перед покрытием.
3. Человек покрытие ламинин решение: развести 1 мл человеческой решение ламинин (0,5 мг / мл в Трис буферизацией NaCl, хранить при -80 ° С, медленно таять при температуре 4 ° С в течение 1-2 часов) с ледяной DMEM или DMEM/F12 к 12,5 мл рабочего раствора (40 мкг / мл) под капотом стерилизованные культуры ткани непосредственно перед покрытием.
4. Фактор роста фондовых решений (500-1000X): растворить фактора роста в 10 мкг/ Мл в буфере стерилизованные (0,5% БСА, 1,0 мМ DTT, 10% глицерина, 1XPBS) и сохранять в качестве 50-100 мкл / трубка аликвоты при -80 ° C.
5. Все-транс-ретиноевой кислоты рабочего раствора (1000X): 10 мм в ДМСО, магазин в аликвоты при -80 ° C.
6. HESC СМИ: DMEM/F12 или КО-DMEM (80%), KO сыворотке замены (20%), L-аланин-L-Gln или L-Gln (2 мМ), MEM заменимые аминокислоты (MNAA, 1X), и β-меркаптоэтанол (100 мкМ), фильтруют и хранят при температуре 4 ° С с добавлением 20 нг / мл bFGF перед использованием. Или заменить "выбить (KO) сыворотки замены" с определенными компонентами: DMEM/F12 или КО-DMEM (100%), L-аланин-L-Gln или L-Gln (2 мМ), MNAA (1X), MEM существенным аминокислот (MEAA, 1X) и β-меркаптоэтанол (100 мкМ), фильтруют и хранят при температуре 4 ° С с добавлением bFGF (20 нг / мл), инсулин человека (20 мкг / мл), аскорбиновой кислоты (50 мкг / мл), человеческого активин (50 нг / мл), человеческий альбумин / Albumax (10 мг / мл), и человеческого трансферрина (8 мкг / мл) перед использованием.
7. НСК СМИ: DMEM/F12 (100%), N-2 supplemeнт (1X), гепарин (8 мкг / мл).

2. Пластина покрытия

1. Пальто пластин с желатином: добавить 2,5 мл / лунку раствора желатина до 6 луночных и инкубировать в течение ночи в 37 ° С увлажненным инкубатора.
2. Пальто пластин с ламинин: холод желатин пластинками, покрытыми и удалить желатин, добавить 2,5 мл / лунку Матригель или человеческого ламинина покрытие рабочего раствора предварительно охлажденное желатинизированный 6-луночных планшетов и инкубировать при температуре 4 ° С в течение ночи.

3. Пассажей и посевные Недифференцированная ЭСК при определенных условиях

1. Разрешить чЭСК колонии вырастают на 5-7 дней от роду, и возьмите пластинку чЭСК культуры рассекает микроскопом (предварительно теплой рассекает этапе до 37 ° C) под рассекает стерилизовать капотом.
2. Выберите чЭСК колонии должны быть разделены. Морфологически эти колонии должны иметь> 75% недифференцированные ЭСК (небольших компактных ячеек), как правило, немного непрозрачной (не белым ворсом деятельность клеток, не ясно дифференцированных клеток) с определенными край ООНderneath рассекает микроскопом. Тщательно контур выбранного колоний и удалите слой дифференцированных фибробластов вокруг колонии и все дифференцированных частей (если таковые имеются) колонии с краю P2 стерильный наконечник пипетки или вытащил стеклянный капилляр. (Обратите внимание, что плюрипотентные ЭСК находятся на переходном этапе, подвергаются спонтанной дифференциации даже при оптимальных условиях, хотя предпочтительнее, трудно установить клетки тезисы на 100% недифференцированные при вскрытии микроскоп,> 75% недифференцированное, как правило, рассматривается как пройти точку. дифференцированных клеток обычно не будет семян и продолжают расти, устранены в процессе пассажей)
3. Удалите старый средах, содержащих отдельные плавающие дифференцированные клетки путем аспирации. Промыть чЭСК СМИ (без bFGF) один раз. Добавьте 3 мл / лунку свежим чЭСК среде, содержащей 20 нг / мл bFGF.
4. Вырежьте недифференцированное колонии чЭСК на мелкие кусочки, и отделить стерильным наконечником пипетки или вытащил стеклянный капилляр.
5. Бассейн средах, содержащих отдельные части колонии вместе в 50 мл коническую трубку. Промыть пластины один раз с 1 мл / лунку СМИ чЭСК, содержащей 20 нг / мл bFGF и бассейн вместе.
6. Аспирируйте Матригель или человеческого ламинина решение от покрытых свежей пластинки. Алиготе 4 мл / лунку чЭСК средах, содержащих колонии штук 6-луночный планшет. Аккуратно передачи пластины в инкубатор без встряхивания и позволяют семян колонии части ночью, не мешая в увлажненный 37 ° C инкубатор атмосфере 5% CO _2.

4. Нейронные Индукция ЭСК под определенные культуры система с ретиноевой кислотой

1. На 3-й день после посева, удалить большую часть старых СМИ из каждой лунки пластины и оставить достаточно средств массовой информации, чтобы чЭСК колонии под воду (никогда не позволит ЭСК высохнуть). Замените 4 мл / лунку свежим чЭСК средах, содержащих 20 нг / мл bFGF и 10 мкМ ретиноевой кислоты.
2. Замените старые СМИ со свежими СМИ чЭСК, содержащей 20 нг / мл и bFGF10 мкМ ретиноевой кислоты через день, и позволяют нейронных вызванной колонии чЭСК вырасти до день 7 или 8. Все клетки в колонии претерпит изменения морфологии на больших дифференцированных клеток, которые будут продолжать размножаться. Колониях будет увеличиваться в размерах, чтобы покрыть пластину день 7 или 8, и клетки начинают накапливаться в некоторых районах колоний.

5. Продолжая нейронов Дифференциация в суспензионной культуре

1. Возьмите чЭСК культуры пластину рассекает микроскопом (предварительно теплой рассекает этапе до 37 ° C) под рассекает стерилизовать капотом. Аккуратно наметить колоний фибробластов и удалить слой, окружающий колонию (дифференцированные клетки мигрировали из колонии) с краю P2 стерильной кончика пипетки или вытащил стеклянный капилляр.
2. Удалите старый средах, содержащих отдельные плавающие клетки фибробластов на аспирационных. Промыть чЭСК СМИ (без bFGF) один раз. Добавьте 3 мл / лунку свежим чЭСК СМИ (без bFGF).
3. Вырезать нейронных-яnduced колонии чЭСК на мелкие кусочки, и отделить стерильным наконечником пипетки или вытащил стеклянный капилляр.
4. Бассейн средах, содержащих отдельные части колонии вместе в 50 мл коническую трубку. Промыть пластины один раз с 1 мл / лунку СМИ чЭСК (без bFGF) и бассейн вместе.
5. Алиготе 4 мл / лунку бессывороточной чЭСК средах, содержащих колонии штук 6-и сверхнизких пластиной крепления и инкубировать при 37 ° C увлажненный инкубатор, чтобы плавающие сотовой кластеров (нейробластов) с образованием в течение 4-5 дней.

6. Созревание нейронов Фенотип в клей культуры

1. Бассейн средах, содержащих плавающие нейробластов вместе в 50 мл коническую трубку. Центрифуга при 1400 оборотов в минуту в течение 5 мин. Аспирируйте старые СМИ столько, сколько вы можете и добавить равное количество свежего НСК средах, содержащих VEGF (20 нг / мл), NT-3 (10 нг / мл) и BDNF (10 нг / мл).
2. Внесите вверх и вниз, смешать плавающей нейробластов и аликвоту 4 мл / лунку до 6-луночных планшетах. Нейробластов также может быть таковойEDED в ламинин / коллагена (Матригель) или человеческого ламинина полимеризованного 3-мерных матриц в бессывороточной СМИ НСК содержащей VEGF (20 нг / мл), NT-3 (10 нг / мл) и BDNF (10 нг / мл) . Передача пластин 37 ° С увлажненным инкубатор, чтобы нейробластов приложить на ночь.
3. Замените НСК средах, содержащих VEGF (20 нг / мл), NT-3 (10 нг / мл) и BDNF (10 нг / мл) через день. Обширная сеть аксонов несущие нервные клетки и пигментные клетки начнут появляться в течение 2 недель непрерывного выращивания и увеличение числа со временем, а может быть сохранен в течение более 3 месяцев.

7. Представитель Результаты:

Ретиноевая кислота (RA) оказывается достаточным, чтобы вызвать ЭСК сохраняются в системе культуры определен переход от плюрипотентности исключительно фенотип нейроэктодермальная (рис. 2). Под воздействием недифференцированных ЭСК в Армении, все клетки в колонии претерпит изменения в морфологиибольшой дифференцированных клеток, которые перестают выражения плюрипотентности связанных маркеров, о чем свидетельствует Oct-4, и начать выражения различных нейроэктодермы связанных маркеров, таких как HNK1, AP2 и TrkC (рис. 2В). Эти большие дифференцированные клетки будут продолжать размножаться и колониях будет увеличиваться в размерах, исходя спонтанно выразить ранних нейронов маркер β-III-тубулина (рис. 2В). Более зрелых нейронов маркер Карта-2 начнут появляться в районах колонии, где клетки накопились (рис. 2В). Одновременно с появлением клетки нейроэктодермальная и нейронных дифференциации нейронов конкретных транскрипционный фактор Nurr1, причастных к дофаминергических нейронов дифференциации и активации тирозингидроксилазы (TH) гена ^16, будут перемещать на ядро (рис. 2В). После индивидуальный РА обработанных ЭСК составит плавающей сотовой кластеров (нейробластов) во взвешенном культаЮр продолжать нейронных процессов дифференциации. При снятии bFGF и после разрешения нейробластов приложить к пластине культуре ткани или высевают в ламинин / коллаген полимеризованного 3-мерные матрицы в бессывороточной определенной среде, β-III-тубулина и карта-2-выражения, нейритов несущие клетки и пигментные клетки начнут появляться с резким увеличением эффективности по сравнению с спонтанной мульти-линии дифференциации ЭСК без лечения за тот же период времени, и может быть сохранен в течение более 3 месяцев (рис. 2).

Рисунок 1 Схема хорошо контролируемых эффективной индукции стволовых клеток человека плюрипотентных исключительно частности клинически соответствующую линию от простого предоставления небольших молекул.

Рисунок 2 ретиноевая кислота вызывает нервный спецификации линии и нейронных прогрессии прямого плюрипотентности при определенных условиях. () Схематическое изображении линии протоколе время направлены нейронов дифференциации ЭСК. (Б) При воздействии недифференцированных ЭСК в ретиноевая кислота (RA) в установленном системе культуры, большой дифференцированной октября-4 (красный) негативные клетки в колонии стали возникать, по сравнению с макетом лечение (ДМСО) ЭСК, как контроль . RA-индуцированной дифференцированных октября-4-негативные клетки начали выражать HNK-1 (красный), AP2 (красный), TrkC (зеленый), а затем β-III-тубулина (красный), в соответствии с ранней дифференциации нейроэктодермальная. Эти клетки продолжали зрелого выражения в конечном счете, нейронный маркер Карта-2 (зеленый), как правило, в районах, где клетки начали накапливаться. Одновременно с появлением клетки нейроэктодермальная и нейронных дифференциации нейронов конкретных транскрипционный фактор Nurr1 (зеленый), причастных кдофаминергических нейронов дифференциации и активации тирозингидроксилазы (TH) гена, перемещаются к ядру. Все клетки показаны DAPI окрашивания их ядер (синий). (C) Р. А. Лечение вызывает дифференциация по отношению к линии нейронов с высокой эффективностью по оценке обширные сети нейритов несущие клетки, экспрессирующие β-III-тубулина (красный) и карта-2 (зеленые, как показано на 3-мерных матриц). Стрелки указывают пигментных клеток типичными для продукта, в ЦНС. Все клетки показаны DAPI окрашивания их ядер (синий) на вставках. Шкала бары: 0,1 мм.

Обсуждение

Одной из основных задач в области развития и исследования и клинические перевод был как канал широкие возможности дифференциации плюрипотентных стволовых клеток человека, чтобы желаемый фенотип эффективно и предсказуемо. Хотя такие клетки могут дифференцироваться спонтанно в пробирке в клетки всех зародышевых листков, пройдя через несколько линия совокупного этапе, лишь небольшая часть клеток заниматься данной ^1,4 линии. В те чЭСК полученных агрегатов, одновременное появление значительного количества широко расходящиеся нежелательных типов клеток, которые могут находиться в трех эмбриональных зародышевых листков часто делает появление желаемого фенотипа не только неэффективно, но неконтролируемые и ненадежными, а также. Хотя сердечные и нервные линий были получены в предыдущих докладах, однако, неэффективность в создании специализированных клеток зародыша через слой индукции плюрипотентных клеток и высоким риском туморогенность следующие transplantatioн препятствуют дальнейшие клинические перевода.

ЧЭСК линий изначально были получены и поддерживаются в сотрудничестве с ростом культуры арестован мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs) ^4. Хотя несколько человек фидер, фидер, свободных и химически сформулированы системы культуры были разработаны для ЭСК ^11-13, элементы, необходимые и достаточные для поддержания самообновления клеток человека плюрипотентных остаются нерешенными. Эти внешние фидерные клетки и биологических реагентов поддержания долгосрочного стабильного роста недифференцированных ЭСК в то время как маска способности плюрипотентных клеток реагировать на сигналы развития. Поддержание недифференцированного ЭСК в определенном биопрепаратов без культуры система, которая позволяет верным расширения и управляемым прямым дифференцированием является одним из ключей к их терапевтической полезности и потенциал. РА было недостаточно, чтобы вызвать дифференциацию нейронов недифференцированных ЭСК сохранены в рамках ранее сообщалось Кондитионы, содержащие экзогенные фидерные клетки. Хотя нейронные линий появляются на относительно ранней стадии в чЭСК дифференциации, рассматривая чЭСК дифференцированных мульти-линии агрегаты (эмбриоидных органов) с РА незначительно увеличилась низкий выход ^{1 нейроны, 14, 15.} Для того чтобы добиться равномерно преобразования человека плюрипотентных стволовых клеток к определенной линии, мы использовали определенную культуру системы, способной страхования размножения недифференцированных ЭСК определить условия для хорошо контролируемых эффективной индукции плюрипотентных ЭСК исключительно частности клинически соответствующую линию от простого предоставления малых молекул (рис. 1, рис. 2). Будущие исследования позволят выявить генетические и эпигенетические молекул управления в развитии человека ЦНС в качестве альтернативы, которая может проложить путь для малых молекул-опосредованного прямого контроля и модуляции чЭСК судьба плюрипотентных при выводе клинически соответствующих линий для регенеративной терапии. Без лечения РА, 1-5% ЭСК подвергнется спонтанной дифференцировке в нейроны ^{1, 14, 15.} При лечении РА, мы были способны генерировать> 95% эмбриональных нейронов и нейронов прародителей из ЭСК поддерживается под определить культуру в процесс, который может имитировать человеческие эмбриональные развития ^14. В последнее время известные нейронные-рок определения генов, были использованы для transdifferentiate мышиных фибробластов во взрослую нейронных прародителей и нейроны с низкой эффективностью пределах 0,5-8%, ^{17, 18.} Тем не менее, перепрограммировать соматические клетки были исторически связаны с аномальной экспрессии генов и ускоренное старение с нарушением терапевтическую полезность ^19-21. Наконец, протокол мы установили здесь ограничивается плюрипотентных ЭСК происходит от внутренней клеточной массы (ICM) или эпибласта из человеческой бластоцисты ^4, могут не распространяться на другие клетки плюрипотентные, в том числе животного возникли эмбриональные клетки, ЭСК производным от ранее морулы (восемь -клетки) стадии эмбриона ²² и artificially перепрограммировать клетки ^23.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии (необязательно)
Желатин	Сигма	G1890
Матригель	BD биологических наук	356231	Рост фактора снижается
Человек ламинин	Сигма	L6274
полностью транс-ретиноевой кислоты	Сигма	R2625
DMEM/F12	Invitrogen	10565018
DMEM	Invitrogen	31053036
DMEM-KO	Invitrogen	10829018
Плей-сыворотка замены	Invitrogen	10828028
MEM несущественные аминокислот раствор кислоты (MNAA, 100X)	Invitrogen	11140050
MEMМино кислоты раствором (MEAA, 100X)	Invitrogen	11130050
β-меркаптоэтанол	Invitrogen	21985023
Albumax	Invitrogen	11020021
Аскорбиновая кислота	Сигма	A4403
Трансферрина человека	Сигма	T8158
Человек bFGF	PeproTech	AF-100-18B
Инсулина человека	Invitrogen	12585014
Человек активин	PeproTech	120-14E
Человек BDNF	PeproTech	AF-450-02
Человек VEGF	PeproTech	AF-100-20
Человек NT-3	PeproTech	450-03
Гепарин	Сигма	H5284
N-2 дополнения (100X)	Invitrogen	17502048
6-и сверхнизких привязанности пластины	Гранулирование	3471
6-луночный планшет	Гранулирование	3516