МИССИЯ LentiPlex Объединенные shRNA библиотеки Скрининг в клетках млекопитающих

Резюме

Здесь мы используем человека LentiPlex объединенные библиотеки и традиционной последовательности методов идентификации генов цели содействия выживаемость клеток. Мы демонстрируем, как настроить и deconvolute LentiPlex экрана и проверять результаты.

Аннотация

РНК-интерференция (RNAi) является внутренним клеточным механизмом для регулирования экспрессии генов. Использование врожденной силой этой системы позволяет нокдаун уровни экспрессии генов в потере исследования функции гена.

Существуют два основных метода выполнения RNAi. Первым из них является использование малых интерферирующих РНК (siRNAs), которые являются химически синтезированных, а второй использует короткие шпильки РНК (shRNAs) закодирован в плазмиды ^1. Последнее может быть трансфекции в клетки прямо или упакованы в репликации некомпетентного лентивирусов частиц. Основные преимущества использования лентивирусов shRNAs является простота внедрения в различные типы клеток, их способность стабильно интегрироваться в геном долго нокдаун гена срок и отбор, и их эффективность в проведении высокой пропускной потеря функции экранов. В целях содействия этому мы создали LentiPlex объединенных shRNA библиотеки.

MISSION LentiPlex правам shRNA Объединенные библиотеки генома лентивирусов бассейна производится с использованием запатентованной технологии. Библиотека состоит из более чем 75000 конструкций shRNA из коллекции TRC ориентации 15.000 + гены человека ^2. Каждая библиотека проверяется на представление shRNA перед выпуском продукта для обеспечения надежного покрытия библиотеки. Библиотека представлена ​​в готовом к использованию лентивирусов формате на титры не менее 5 х 10 ⁸ TU / мл через p24 анализа и предварительно разделены на десять подпулы приблизительно 8000 shRNA конструкции каждого из них. Усиление и последовательности праймеров предоставляются также ниже по течению идентификации цели.

Предыдущие исследования создан синергетический противоопухолевую активность по TRAIL в сочетании с паклитакселом в A549 клетки, легких человека рак линии ^{3, 4.} В этом исследовании мы демонстрируем применение объединенных библиотек LentiPlex shRNA быстро проводить положительные экране выбора для генов, участвующих в цитотоксичности ое A549 клетки при воздействии на TRAIL и Паклитаксел. Одним из препятствий часто встречаются с высокой пропускной способностью экранов стоимость и трудности в деконволюции, мы также подробно экономически эффективных поликлональных подход с использованием традиционных секвенирования.

протокол

LentiPlex Объединенные Настройка экрана

Чтобы определить shRNA последовательности интерес, важно создать на экране так, что большинство клеток получают только один shRNA конструкции. При использовании низких МВД (множественность инфекции), вероятность нескольких integrants на клетку значительно уменьшилось. Тем не менее, эффективность трансдукции, и поэтому желаемый Mois, сильно зависят от типа клетки-мишени. Поэтому крайне важно, чтобы определение оптимального МВД проводится перед началом экрана в новый тип клеток.

1. Трансдукция клеток-мишеней с Миссией LentiPlex Объединенные shRNA библиотека

1. Фактическое МВД использоваться будет варьироваться для разных типов клеток. Если повторяет желательны то количество пластин должна быть увеличена соответственно. Кроме того, обычно это не будет выгодно комбинировать различные подпулы. Хранение подпулы отдельных поможет в процессе деконволюции. Обеспечить ргореГ маркировки каждого блюда культуре ткани с подпул номер, который наносится при трансдукции. Низкий МВД рекомендуется уменьшить вероятность нескольких integrants на ячейку.
2. День 1 - Seed соответствующее количество 60-мм блюда с достаточно клеток для получения ~ 70% слияния на следующий день (10 бассейнов в общей сложности, каждая выполнена в трех экземплярах = 30 блюд общего числа). Для нашего исследования, 60 блюд мм засевали с 6 х 105 A549 клетки для достижения слияния 70% до трансдукции. Это гарантирует, что клетки все еще находятся в экспоненциальной фазе роста. Темпы роста будут отличаться в зависимости от типа клеток и должны быть определены до начала экрана.
3. Разрешить клетки придерживаться путем инкубации в течение ночи при 37 ° C в увлажненной инкубатора в атмосфере 5% CO _2.
4. (Опционально) включать два дополнительных 60-мм блюда для трансдукции с отрицательным shRNAs контроля. Этикетка блюда "Контроль" для SHC001H и "Контроль B" для SHC002H.
5. День 2 - преобразовывать йэлектронной клеток с LentiPlex вирусных частиц. В день трансдукции, оттепель лентивирусов частиц на льду.
6. Передача талой частиц ламинарном боксе и держать на льду, если не используется немедленно.
7. Рассчитайте, сколько каждого отдельного вирусных суб-бассейн, чтобы добавить к клеткам, чтобы получить МВД 1 во всех блюдах клеточной культуры.
   1. Пример: 1 х 10 ⁶ клеток / блюдо; вирусный титр = 5 х 10 ⁸ TU / мл; желаемого МВД 1. i.) 1 х 10 ⁶ клеток / блюдо х (МВД 1) = 1 х 10 ⁶ трансдуцирующих единиц (ТУ), которые необходимы II.) 1 х 10 ⁶ ТУ / (5,0 х 10 ⁸ TU / мл), полученный из С = 2 мкл лентивирусов маточного раствора следует добавить соответствующие блюда. Развести рассчитанное количество вируса в 100-300 мкл полной информации в целях обеспечения более эффективного распределения вируса при добавлении к блюду культуре клеток.
8. Удаление информации из предварительно отобранные клетки. Добавить полное СМИ Контакining решение hexadimethrine метила для каждого блюда. Рекомендуется конечной концентрации hexadimethrine метила в СМИ 8 мкг / мл. Используйте меньше hexadimethrine бромид, если вы найдете его быть токсичными для ваших клетках-мишенях.
9. Добавить shRNA лентивирусов частиц соответствующие блюда в соответствии с заранее определенным экспериментальным дизайном. Аккуратно водоворот пластины для равномерного распределения вируса через клетки.
10. Инкубируйте 18-20 часов при температуре 37 ° C в увлажненной инкубатора в атмосфере 5% CO _2.
11. (Необязательно) Повторите 3-8 на идентичные МВД с SHC001H (пустой вектор shRNA контроля) в Управление блюдо и SHC002H (закодированная shRNA управления) управления Блюдо Б. Лечить эти блюда одинаково экспериментальным блюда в течение всего эксперимента.
12. День 3 - изменение средств массовой информации. Аспирируйте вируссодержащих СМИ и добавить свежий полный СМИ (без бромид hexadimethrine). Инкубируйте клетки при температуре 37 ° С в течение ночи.

2. Лечить покрытиемклетки с лечебными компонентами / реагента

1. День 4 - аспирацию средств массовой информации из колодцев и добавить свежий средах, содержащих терапевтические компоненты при оптимальной концентрации. Как и условий культивирования, лечение будет меняться и надлежащей концентрации и длительности должны быть определены заранее. В нашем исследовании мы использовали 100 нг / мл TRAIL и 1 мкМ Паклитаксел. Клетки получали лечение в течение 48 часов.
2. Выжившие клетки должны быть вновь посеяны в T75 колб и позволило расширить почти до 100% вырожденная.
3. (Дополнительно) в конце отбора, проверки управления Блюдо и контроля Блюдо Б. Блюдо Блюдо и B должны каждый иметь меньше колоний, чем хотя бы одного из объединенных блюда библиотеки. Если Есть неожиданно большое количество колоний в блюдо, чем любой трансдукции процесс затронул пути, связанные с желаемой фенотип или селективное давление не является достаточно сильной и повторной оптимизации анализа может оказаться необходимым. Если блюдо B содержит слишком много колоний, То выражение shRNA и привлечение пути RNAi может иметь влияние на фенотип интерес. Если это так повторите с SHC001H, чтобы убедиться, что эффект не является специфичным для SHC002H.

3. Деконволюции из поликлональных популяции клеток

1. Урожай гетерогенной популяции клеток друг от подпул и изолировать геномной ДНК. В нашем суде, клетки отмывали в PBS кратко и трипсином до геномной ДНК выделяли с использованием GenElute млекопитающих Геномная Miniprep комплект и поставляется протокол (Sigma-Aldrich, G1N70). Кроме того, любой другой геномной очистка комплекты, которые в настоящее время доступны на рынке, могут быть использованы для выделения ДНК. Важно следовать протоколу рекомендации для начала количество культивируемых клетках.
2. ПЦР-амплификации цели. Восстановление shRNA шаблон процедура позволяет усиление весь пул вставок shRNA от выбранной ячейки населения, или извлечение индивидвойные шаблоны shRNA из колоний, которые были индивидуально подобранный и расширены. После усиления вставок shRNA из-под контроля и отдельные клетки-мишени, ПЦР-продукты могут быть упорядочены.
3. Этот шаг ПЦР-амплификации был оптимизирован с использованием Сигма Readymix, каталог номер P2893. Другие реагенты могут быть использованы для усиления, но езда на велосипеде условий и / или концентрации магния, возможно, должны быть изменены для успешного усиления. Усиление праймеров в концентрации 20 мМ включены LentiPlex комплект.
4. Настройка реакции ПЦР, как описано в таблице 1. Добавить компоненты в указанном порядке. Описаны суммы для одного 50 мкл реакции. Для более реакции, масштаб компонентов мастер микс от желаемого количества реакций и включают 10% превышения. Количество ДНК шаблон рекомендуется составляет 50-100 нг.
5. Настоятельно рекомендуется, чтобы для одной реакции шаблон состоит из МИССИЯ shRNA правам Положительные векторного управления разбавляют до approprИАТЭ концентрации. Успешное усиления с помощью этого шаблона указывает, что ПЦР компонентов и велосипедных условия являются адекватными. ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения переноса загрязнения экспериментальных образцов и реактивов, он предположил, что положительный контроль развести в отдельном месте, откуда последующие реакции ПЦР настроены.
6. Сохранить ПЦР программ, перечисленных в таблице 2, в свою амплификаторе.
7. Для каждого образца, объединить 3 мкл ПЦР-реакции с 1 мкл красителя и electrophorese наряду с 5 мкл DirectLoad ™ ПЦР 100 б.п. Низкие Лестница, Номер в каталоге D3687 на 1% агарозном геле, чтобы подтвердить наличие 309 ампликона ВР.
8. Субклонирование ПЦР-амплификации: Продукты ПЦР клонировали использованием ТОПО ТОПО-TA клонирования комплект, следуя протоколу производителя (Invitrogen, K4575-01). В результате получается, что одна ПЦР-продукта содержится в каждом векторе.
9. 250 индивидуальных бактериальных колоний (каждый из которых содержит отдельный ПЦР ампликона) были выделены и растип в 2 мл культуры LB 100 мг / мл ампициллина. ДНК плазмиды тогда извлекали с помощью плазмиды GenElute Miniprep комплект (Sigma-Aldrich, PLN70).
10. Очищенная плазмиды ДНК переваривали EcoRI и электрофорезу, чтобы подтвердить наличие вставки.
11. Образцы ДНК плазмиды были затем последовательно и вставить shRNA идентифицируются с помощью последовательности LentiPlex shRNA Поиск в базе данных предоставляется LentiPlex библиотеки.

4. Идентификация и проверка Целевая

1. Последовательность shRNA инициирует с 5'-GAAACACCGG-3 '. Введите крайней мере в ближайшие 10, но менее 21 нуклеотидов, как последовательность запросов в поле поиска на прилагаемом Последовательность shRNA Форма поиска базы данных Access.
2. Выберите вид объединенных shRNA. При необходимости выберите подпул, из которой последовательность была найдена.
3. Теперь нажмите на кнопку "Найти потенциальных хитов" кнопку, чтобы выполнить поиск. Это должны определить соответствующие TRC shRNA последовательность (ы), которые соответствуют йэлектронной последовательности данных. Более подробную информацию о последовательности TRC shRNA (ы) определены и соответствующие цели гена можно легко найти на Sigma-Aldrich ваш любимый Гена: http://www.sigma.com/yfg
4. Выявленные генов-мишеней должны быть проверены путем повторения оригинального анализа скрининг с оригинальным клон TRC плюс по меньшей мере два дополнительных shRNAs, что цель и того же гена с использованием 1 shRNA к 1 и формата. Правда хитов продемонстрирует такой же фенотип в большинстве скважин.

5. Представитель Результаты

Примером LentiPlex объединенных экран рабочего процесса, изображенной на рисунке 1. Трансдуцированных клетки, которые распространились в присутствии TRAIL и Паклитаксел было позволено расширить до колбы вырожденная. Геномная ДНК была собирают и подвергают ПЦР-амплификации и клонирования, как показано на рисунке 1, до его представления для идентификации последовательности и shRNA, как описано в FIGUотносительно 1 С. 250 клонов секвенировали, из них 25 были представлены несколько клонов, а остальные 225 были представлены только 1 клон и не преследовали в это время.

Как показано на рисунке 2, несколько генов-кандидатов, включая TBX3, PPP2CA и AKT2 были представлены несколько клонов. Т-поле транскрипционный фактор, TBX3 появился в общей сложности четыре клонов и был вовлечен в опухолевых миграцией ^5. PPP2CA подавление было продемонстрировано, чтобы поддерживать рост LNCaP клеток, культивированных в условиях недостаточной андрогенов, освободив андроген-лишение вызванных клеточного цикла ареста и предотвращения апоптоза ^6. AKT2 является RAC-бета-серин / треонин-протеинкиназ и предполагаемый онкоген продемонстрировали играть несколько ролей в развитии рака ^{7, 8.}

* Окончательные концентрации Mg ^{2 +} в растворе будет 3 мм;1,5 мМ вносится от Taq Readymix и 1,5 мм из раствора хлорида магния.
Таблица 1. Lentiplex Условия ПЦР реакции

Таблица 2. Lentiplex ПЦР-амплификации программе

Рисунок 1. (А) LentiPlex объединенных экран, (B) Поликлональные рабочий процесс деконволюции, и (C) определение целей shRNA.

А. LentiPlex объединенного экрана. Во-первых, семенной клетки, а затем добавить shRNA подпулы, (10 бассейнов в общей сложности, каждая выполнена в трех экземплярах, в течение 30 блюд общего числа). Затем обработайте терапевтического компонента / реагента (в нашем случае, TRAIL и Паclitaxel, соответственно). Затем, осеменяют выживших клеток в колбах и позволит расширить. Урожай гетерогенной популяции клеток друг от подпул и изолировать геномной ДНК.

Б. Поликлональные деконволюции. Выполните ПЦР для амплификации ДНК, содержащей вставки shRNA. ПЦР продукт одинаковыми по размеру, но поликлональных в определенной последовательности с шаблоном gDNA также поликлональных. ПЦР продукт клонировали в вектор, а затем превращаются в компетентные бактерий.

C. Определение целей shRNA. Индивидуальные колонии изолированы и плазмидной ДНК извлекается. Каждый клон содержит клонирования вектор с одного человека ПЦР-фрагмента. Плазмидной ДНК переваривается, чтобы подтвердить наличие вставки и секвенировали. Вставить shRNA определяется с помощью последовательности LentiPlex shRNA базы данных поиска.

Рисунок 2. Выявленные МожетГены кандидатах. 25 генов-кандидатов было выявлено, что было несколько хитов. 225 генов-кандидатов был только один хит и не были продолжены. Пожалуйста, смотрите дополнительную таблицу 1 для разбивки отдельных клонов одного кандидата гена.

Дополнительное таблице 1. Индивидуальные TRC библиотека клонов идентифицированы Поликлональные ID секвенирования генов Хиты Обнаруженные клонов.

Обсуждение

В этом исследовании мы представляем генома экран для идентификации генов, вовлеченных в цитотоксичность A549 клеток после паклитаксел / TRAIL лечения. Использование объединенного подхода в геном-широкий экран позволяет сократить время, затраты и инвестиций в оборудование, обычно связанных с обычными выстроились экранов. Важнейшее значение для успеха экрана оптимизации экспериментов заранее. Трансдукция условия и МВД должны быть определены эмпирически.

Выбор метода должен предусматривать надежный выбор клеток, воспроизводящих желаемый фенотип (например, выживание, поверхность экспрессии белка и т.д.). Оптимизация этих параметров позволит снизить количество ложных срабатываний обнаружено.

Здесь gDNA был собран от основной массы населения выделенных ячеек, а затем ТОПО клонированных для идентификации отдельных вставками shRNA. Одним из возможных улучшение для этого эксперимента было бы выбрать для живых клеток с использованием FACS обеспечениечто только живые клетки собираются. Определены целевые показатели будут утверждены трансдукции с целевыми конкретных shRNAs в скрининге. Правда хитов появится фенотипа в большинстве скважин.

LentiPlex Объединенные библиотека является гибким в его применении. Он совместим с широким спектром приложений и вниз по течению могут быть использованы с положительным или отрицательным стратегии выбора. В зависимости от условий скрининга, деконволюции вставками shRNA выполняется с помощью ПЦР / клонирование, микрочипов, или следующего поколения секвенирования ^{9, 10.} В то время как мощность и скорость этих методов deconvolute RNAi экраны хорошо известно, одна обеспокоенность микрочипов и следующего поколения секвенирования методов является наличие биоинформатики ресурсов и знаний, необходимых для правильного анализа и интерпретации экспериментальных результатов. Расходы, связанные с этими методами часто может раз стать препятствием для проведения генома широкие экраны. APCR / клонирования подход, хотя и не такая мощная, как и микрочипы нового поколения секвенирования эффективной и недорогой альтернативой.

Компания Agilent предлагает пользовательский массив, основанный на библиотеке TRC shRNA дальнейшей помощи в LentiPlex экранов. Эти опции позволяют исследователям использовать LentiPlex для изучения разнообразных клеточных функций.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге
LentiPlex Объединенные массива	Sigma-Aldrich	SHPH01
Клетки A549	АТСС	CCL-185
TRAIL	Sigma-Aldrich	oductDetail.do? LANG = EN & N4 = T5694% 7CSIGMA & N5 = SEARCH_CONCAT_PNO% 7CBRAND_KEY & F = SPEC "> T5694
Паклитаксел	Sigma-Aldrich	T7402
Topo Т. А. Клонирование Kit	Invitrogen	K4575-01
JumpStart Taq Readymix	Sigma-Aldrich	ONCAT_PNO% 7CBRAND_KEY & F = SPEC "> P2893
GenElute плазмиды комплект Miniprep	Sigma-Aldrich	PLN70
EcoR1	New England Biolabs	R0101
hexadimethrine бромид	Sigma-Aldrich	H9268