Создание вирусом Эпштейна-Барра роста трансформированных лимфобластоидных клеточных линий

Резюме

Мы описываем метод генерации преобразован В-клеток линий с использованием вируса Эпштейна-Барра. Мы также иллюстрировать роман анализа, которая позволяет обнаруживать В-клеток суждено трансформироваться еще в три дня после заражения.

Аннотация

Заражение В-клеток с вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ) ведет к увековечению распространения и последующего, в результате создания лимфобластоидных клеточных линий (LCL) в пробирке. Поскольку LCL являются латентно инфицированных ВЭБ, они обеспечивают модели системы расследования EBV задержки и вирусов управляемой B пролиферации клеток и опухолей ^1. LCL были использованы для представления антигенов в различных иммунологических анализах ^{2, 3.} Кроме того, LCL может быть использован для создания человеческих моноклональных антител, ^{4, 5} и обеспечивают потенциально неограниченный источник, когда доступ к первичным материалам биологических ограничено ^{6, 7.}

Различные методы были описаны для создания LCL. Ранее методы включали использование митогены, таких как фитогемагглютинином, липополисахарид ⁸ и ⁹ pokeweed митоген увеличить эффективность EBV-опосредованной увековечение. Совсем недавно, другие использовали immunosupprизобразительных средств, таких как циклоспорин для подавления Т клеточного убийства зараженных клеток B ^{7, 10-12.}

Значительный период времени от инфекции EBV к созданию клеточных линий диски требование для более быстрого и более надежные методы ВЭБ-приводом B преобразования рост клеток. Используя сочетание высокого титра ВЭБ и иммуносупрессивных агентов, мы способны постоянно заражают, преобразования и создания LCL из В-клеток в периферической крови. Этот метод использует небольшое количество мононуклеарных клеток периферической крови, которые заражены в пробирке скопления клеток может быть доказана. Присутствие CD23 с ВЭБ в присутствии FK 506, Т-клеток иммунодепрессанты. Традиционно, следствием пролиферации клеток контролируется визуализации микроскопических кластеров клеток примерно через неделю после инфицирования ВЭБ. Сгустки LCL можно увидеть невооруженным глазом в течение нескольких недель. Мы описываем анализ, чтобы определить рано, если ВЭБ-опосредованной гrowth преобразование успешным еще до того, микроскопические скопления клеток может быть доказана. Присутствие CD23 ^привет CD58 ^{+ клеток} наблюдалось уже через три дня после инфекции указывает на успешный результат.

протокол

1. ВЭБ массоподготовки

1. Субкультура экспоненциально растущей В95-8 клеток (АТСС CRL # 1612; 13) при 3 х 10 ^{5 клеток} / мл в 75 см ² культуре ткани колбу с использованием стерильной техники. Клетки, выращенные в полной RPMI 1640, содержащей 10% тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), пенициллина / стрептомицина на 100U/ml и 100 мкг / мл, соответственно, и амфотерицин на уровне 0,5 мкг / мл при 37 ° С в присутствии 5% CO _2.
2. Сорок восемь часов спустя, ресуспендирования клеток в свежей полной RPMI 1640 на 1 х 10 ⁶ клеток / мл. Для стимулирования производства вируса, стимулируют клетки с 20ng/ml tetradecanoyl форбол ацетат (ДТС) в течение 1 часа в стандартной СО ₂ инкубатора. Вымойте клетки трижды RPMI 1640, чтобы удалить тонн в год.
3. Ресуспендируют клеток в первоначальный объем полной RPMI 1640 (от 1,2) и поместить колбу в CO ₂ инкубаторе в течение 96 часов. Этот метод был показан для получения высоких титров инфекционной номинальной вирусчастиц ^6.
4. Центрифуга при 600 х г в течение 10 мин при 4 ° С до отдельных EBV-содержащих супернатант культуры из клеток. Фильтры супернатанта через 0,45-микронный фильтр, Алиготе, и хранить при температуре -70 ° С в течение более года.
   Альтернативой является получение супернатант из В95-8 клеток, содержащих EBV из АТСС (VR-1492) и использовать в разведении рекомендованных АТСС.

2. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК)

1. Ничья 10 мл крови от донора в гепаринизированной шприца или гепаринизированной трубки крови. Развести крови с 20 мл PBS при комнатной температуре в 50 мл коническую трубку.
2. Подложка разбавленной крови с 15 мл Ficoll Hypaque лимфоцитов средой разделения. Центрифуга при 225 х г без тормозов при комнатной температуре в течение 30 минут.
3. Удалить лейкомассы и передачи в новый 50 мл коническую трубку. Повышение объема до 50 мл PBS и спина при 600 мкг при комнатной температуре в течение 10 минут.
4. Pouт от супернатант. Вымойте клеток ресуспендирования гранул в 50 мл PBS и вращается со скоростью 600 х г при комнатной температуре в течение 10 минут. Мыть два раза больше в подобной манере.
5. Ресуспендируют отмытых клеток в 1 мл полной RPMI. Используйте 5 мкл клеток для подготовки 1 / 10 разведения в Трипановый синий. Граф живых клеток использованием гемоцитометра.
6. Отрегулируйте громкость с помощью полной RPMI в 25 см ² колбы культуры ткани для получения концентрации клеток из 2 х 10 ⁶ / мл.

3. Инфекция EBV

1. Добавить FK506 (А. Г. Научно) для клеточной суспензии от 2,6 до конечной концентрации 20 нМ. Место колбу в CO ₂ инкубаторе при температуре 37 ° С в течение одного часа.
2. Быстрое таяние аликвоту ВЭБ. Удалить колбу из инкубатора и добавить к EBV клеток в 1 / 10 разведения. Как правило, это разведение обеспечивает МВД 50-100. Swirl колбы перемешать и поместить его в вертикальном положении в CO ₂ инкубаторе при температуре 37 ° C.

Примечание йна шаге 4, выполнены, чтобы предсказать успех, это необязательный шаг. Если Шаг 4 должны быть выполнены, то вам нужно для инкубации дополнительные колбы ООН-инфицированных РВМС на 2 х 10 ⁶ клеток / мл в качестве контроля.

4. Определение пролиферирующих популяцию клеток (Необязательный шаг)

1. Подготовка FACS буфера: PBS + 5% FBS. Хранить при температуре 4 ° С.
2. Сделайте следующее антител смесей в объеме 50 мкл каждого для окрашивания клеток в шаге 4.6. Антитела разведения должны быть сделаны в FACS буфера, содержащего 1mg/ml мыши IgG (Sigma) для подавления неспецифическое связывание антителами.
   1. одной окрашивали PE сопряженных анти-CD23 антител (1 / 50 разбавления)
   2. одной окрашивали FITC сопряженных анти-CD58 антител (1 / 50 разбавления)
   3. одной окрашивали PE-Cy5 сопряженных анти-CD19 антител (1 / 50 разбавления)
   4. тройной окрашивают в течение CD23, CD58, CD19 и (1 / 50 разбавления каждого)
   5. одной окрашивали PE сопряженных контроль изотипаантител соответствуют CD23-PE (в той же концентрации, как анти-CD23 антитела)
   6. одной окрашивали FITC конъюгированных антител контроль изотипа согласован с CD58-FITC (при той же концентрации, как анти-CD58 антитела)
   7. одной окрашивали PE-Cy5 конъюгированных антител контроль изотипа согласован с CD19-PE-Cy5 (при той же концентрации, как анти-CD19 антитела)
   8. тройной окрашивали все три антитела изотипа контроля.
   Временного хранения смесей при температуре 4 ° С в темноте.
3. В третий день после контакта с ВЭБ, мягко водоворот колбу для получения более равномерного клеточной суспензии. Удалить из колбы 2 мл в 2 мл пробирку Эппендорфа. Спиновые трубки в микроцентрифужных при 3000 оборотов в минуту при комнатной температуре в течение 3 минут.
4. Аспирируйте супернатант и ресуспендирования клеток в буфер FACS на 5 х 10 ⁶ до 1 х 10 ⁷ клеток / мл.
5. Удалить восемь 50 мкл аликвоты в отдельных трубок Эппендорф или 96-и V-нижней пластине. Спиновые трубы или пластины при 1500 х гв течение 3 минут.
6. Удалите супернатант и вихревые трубки / пластины. Ресуспендируют клеток в каждой пробирке / лунку в 50 мкл FACS буфера, содержащего соответствующие разведения антител подготовлен в 4.2.
7. Инкубируйте труб / пластин на льду в темноте в течение 30 минут. Центрифуга клеток при 3000 оборотов в минуту в течение 3 минут, удалить супернатант, и добавьте 200 мкл буфера FACS. Центрифуга клетки снова и удалите супернатант для завершения стирки. Повторить еще два стирок.
8. Ресуспендируют клеток в 200 мкл FACS буфера и получить данные с помощью проточного цитометра, приобретя 20 000 событий / трубы.
9. Анализ данных с помощью WinMDI (бесплатный для FACS анализ данных на ПК). Ворота на живые клетки с использованием форвардных и боковые профили разброс. Затем ворота живых клеток на экспрессию CD19 ⁺ (В-клеток маркера) после сравнения с клетками окрашивали антителами изотипа контроля соответствуют анти-CD19 антител. Участок CD19 ^{+-клеток} жить с интенсивность флуоресценции для CD23 на оси х и интенсивность флуоресценции для CD58 на оси Y.. Определите CD23 ⁺ CD58 ⁺ и клеток по сравнению с ВЭБ, подвергшихся воздействию клеток, окрашенных соответствие антитела изотипа контроля. Присутствие CD23 ^привет CD58 ^{+-клеток} в ВЭБ, подвергшихся воздействию культуры (рис. 2C) прогнозирует успешный результат ВЭБ-инфицированных роста трансформированных клеток. В противоположность этому, CD23 ^привет CD58 ^{+ клеток} не возникают, когда клетки не подвергаются EBV (рис. 2A) или подвергаться без увековечивания штамм EBV (рис. 2В). CD23 ⁺ CD58 ^привет клетки были экспериментально продемонстрировано пройти распространение и впоследствии установить LCL (14).

5. Расширение и криоконсервации LCL

1. Визуализация клеток с помощью световой микроскопии: По неделю после инфицирования EBV, кластеры клеток видны под световым микроскопом. На рисунке 3 показан пример ранних микроскопических кластеров (рис. 3В) в колбу.
2. С течением времени микроскопические кластеры становятся большими, что скопления виднымакроскопически в колбу. Рис 3C показывает большие скопления клеток в установленном LCL с помощью световой микроскопии.
3. Кормление клетки: Двойной объем культуральной среды в культуре колбу на 12 день. Впоследствии расширить культуру, увеличивая его объем в 2-3 раза использованием полной RPMI.
4. Периодичность кормления клетки должны быть определены на основе скорости роста клеток. При культуральной среде становится желтым, как правило, время, чтобы заменить средства массовой информации, что и выше. Как правило, это происходит один раз в неделю. Однако, некоторые клеточные линии, возможно, придется питаться более или менее часто. Развернуть культуры до 75-100 мл в течение ближайших нескольких недель.
5. Криоконсервация: При замораживании до клетки, клетки центрифуге при 600 х г в течение 10 минут при комнатной температуре. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в холодную среду замораживания содержащей 90% FBS и 10% диметилсульфоксида при 1 х 10 ⁷ клеток / мл. Место трубки в жидком азоте.

6. Представитель результаты:

Успешный результат предсказывается наличие CD23 ⁺ CD58 ^привет клеток. Примерно 2-3% живых клеток на 3-4 день после контакта с ВЭБ должны иметь эту анкету (рис. 2С). Другие субпопуляции CD23 ^+, CD23 ^-, CD58 ⁺ и CD58 ^{- клеток} наблюдается после контакта с ВЭБ показать минимальное распространение ^14. Un-инфицированные клетки (рис. 2A) и клетки подвергаются EBV от HH514-16 клетки (рис. 2В), укрывательство, не увековечивать штамм EBV, не демонстрируют CD23 ⁺ CD58 ^привет клеток.

Вы также можете визуализировать клетки с помощью световой микроскопии для контроля успеха: Как упоминалось ранее, в течение недели после инфицирования EBV, небольшие скопления клеток в колбе видны с помощью световой микроскопии (рис. 3В). Как прогрессирует время и клетки развиваются в LCL, микроскопические кластеры становятся крупнее (рис. 3C), что скопления видны макроскопически в колбу.

Рисунок 1. Workflow для генерации и криоконсервации лимфобластоидных клеточных линий. Периферической крови центрифугируют через градиент Ficoll. РВМС присутствует в пальто Баффи установленного градиента подвергаются FK506 с последующим добавлением ВЭБ. EBV, подвергшихся воздействию клетки выращивают при температуре 37 ° С в присутствии 5% CO _2, установить и в дальнейшем расширять LCL для криоконсервации.

Рисунок 2. Определение субпопуляции лимфоцитов ожидается пройти распространение после контакта с ВЭБ. Un-инфицированных РВМС () или РВМС подвергается EBV основе HH514-16 клеток (B) или В95-8 клеток (C) в присутствии FK506 было собрано на 3 день. Клетки окрашивали флуорохромом сопряженных антител, направленных против CD19, CD23, CD58 и. После стробирования на живой клеткес, не-инфицированных () и ВЭБ, подвергшихся воздействию (В и С) CD19 ^{+-клетки} были исследованы на экспрессию CD23 и CD58. Субпопуляции В-клеток CD58 выражения и высокий уровень CD23 (CD23 ^привет CD58 ^+), наблюдается только в клетках, подвергавшихся к трансформации компетентных EBV (производный от В95-8 ячеек), изображен.

Рисунок 3. Визуализация клеточных кластеров в ВЭБ-инфицированных клеток. РВМС лечили FK506 и инфицированы EBV. Un-инфицированных (А) и ВЭБ, подвергшихся воздействию (В) клетки были рассмотрены одной недели после заражения фазовый контраст микроскопии (10х увеличение). Пять-недельных клеточной линии лимфобластоидных показано на C.

Обсуждение

Метод, описанный в этой статье генерирует LCL-доноров периферической крови с быстрым увековечение и криоконсервации раз. Благодаря использованию FK 506, Т-клеток иммунодепрессанты, а также высокие титры инфекционного вируса, мы можем способствовать распространению ВЭБ-инфицированных В-клеток из периферической крови мононуклеаров. Эти меры делают описанный метод более эффективным, в результате быстрого роста клеток для последующих экспериментов.

Традиционно, рост трансформация была контролируется визуализации скопления клеток с помощью световой микроскопии примерно через неделю после контакта с ВЭБ ^{6, 15.} Тем не менее, кластеризация клеток не из конкретных показателей ВЭБ-опосредованного роста трансформации. Ранее мы уже продемонстрировали последовательную идентификацию пролиферирующих клеточных популяций с помощью проточной цитометрии ^14, обеспечивая точный и конкретный метод для определения успешного результата уже в три дня на кормеэ воздействия В-клеток в ВЭБ.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
	Компания	Номер в каталоге
Амфотерицин	Фишер Bioreagents	BP 928-250
Диметилсульфоксид	Сигма	D 2650
Эмбриональной бычьей сыворотки, тепло-инактивированная	Сигма	F 4135
Ficoll Hypaque СМИ лимфоцитов разделения	Mediatech	25-072
FK506	А. Г. Научное	F 1030
IgG в сыворотке мышей	Сигма	Я 8765
Мышь анти-CD23 человека конъюгированных с PE	BD Pharmingen	555711
Мышь изотипа IgG1 конъюгированных с PE	BD Pharmingen	554680
Мышь анти-CD58 человека конъюгированные с FITC	Пирс Thermo Scientific	MA1-82159
Мышь изотипа IgG1 конъюгированные с FITC	BD Pharmingen	550616
Мышь анти-CD19 человека конъюгированных с PE-Cy5	BD Pharmingen	555414
Мышь изотипа IgG1 конъюгированных с PE-Cy5	Dako	X 0955
Пенициллина / стрептомицина	Гибко	15140-122
RPMI 1640 средств массовой информации	Сигма	R 8758
Tetradecanoyl форбол ацетат (ДТС)	Calbiochem	407952
FACS буфера (1х фосфатным буферным солевым раствором + 5% эмбриональной телячьей сыворотки)