Мониторинг убиквитин-протеасомной активности в живых клетках с помощью Degron (DGN)-дестабилизировали зеленого флуоресцентного белка (GFP)-Reporter на основе белков

Резюме

Метод мониторинга убиквитин-протеасомной активности в живых клетках описано. Degron-дестабилизированный GFP-(GFP-DGN) и стабильный GFP-dgnFS гибридного белка создаются и преобразованных в ячейку с помощью лентивирусов вектор экспрессии. Этот метод позволяет генерировать стабильный GFP-dgn/GFP-dgnFS выражения клеточная линия, в которой убиквитин-протеасомной активности может быть легко оценить, используя эпифлуоресцентной или проточной цитометрии.

Аннотация

Протеасомы является основным внутриклеточным органелл, участвующих в протеолитической деградации ненормально, неправильно свернутых, повреждены или окисленных белков ^{1, 2.} Поддержание активности протеасом был замешан во многих ключевых клеточных процессов, таких как стресс клетки ответ ^3, регуляцию клеточного цикла и клеточной дифференцировки ⁴ или в ответ иммунной системы ^5. Дисфункции убиквитин-протеасомной системы была связана с развитием опухолей и нейродегенеративных заболеваний, ^{4, 6.} Кроме того, снижение активности протеасом был найден как функция клеточного старения и старения организмов ^{7, 8, 9, 10.} Здесь мы представляем метод измерения убиквитин-протеасомной активности в живых клетках с использованием GFP-DGN гибридного белка. Чтобы быть в состоянии контролировать убиквитин-протеасомной активности в живых первичных элементов, комплементарной ДНК строит кодирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP)-DGN гибридного белка (GFP-DGN, неустойчивые) и вариант проведения рамки мутации (GFP-dgnFS, стабильные ^11), которые вставляются в лентивирусов векторов экспрессии. Мы предпочитаем этот метод по сравнению с традиционными методами трансфекции, потому что она гарантирует очень высокую эффективность трансфекции зависит от типа клеток или возраст донора. Разница между флуоресценцией отображается GFP-dgnFS (стабильный) белка и дестабилизировали белка (GFP-DGN) в отсутствие или в присутствии ингибитора протеасом может быть использован для оценки убиквитин-протеасомной активности в каждый конкретный штамм клеток. Эти различия можно контролировать с помощью эпифлуоресцентной микроскопии или может быть измерена с помощью проточной цитометрии.

протокол

1. Плазмида строительства

1. Заказать специальный олиго-нуклеотидов кодировки для DGN (ACKNWFSSLSHFVIHL ¹¹⁾ и для dgnFS (HARTGSLACPTSSSICE) и перевязывать его в pEGFP-C1 вектора для получения слияния GFP с DGN / dgnFS (рис. 1).
2. Усиление последовательности, кодирующей GFP-DGN и GFP-dgnFS методом ПЦР в соответствии с протоколом pENTR направленности Kit клонирования TOPO и продолжить pLenti6/V5 направленности TOPO Cloning Kit (рис. 6).

2. Вирус производства

1. За день до трансфекции (День 1) семя, из НЕК 293FT клеток в колбах T75 так, что они будут 90-95% сливающийся в день трансфекции.
2. В день трансфекции разбавлять 36 мкл липофектамина 2000 реагента в 1,5 мл DMEM без сыворотки и антибиотиков в 15 мл сокола. Используйте другой 15 мл сокола и развести 3 мкг pLenti6/V5 проведения комплементарной ДНК построить для любой GFP -DGN или GFP-dgnFS, 2,5 мкг конверт кодирования плазмиды pMD2.G и 7,5 мкг вектора основу psPAX2 в 1,5 мл DMEM без сыворотки и антибиотиков. Через 5 мин разбавленный ДНК в сочетании с разбавленным липофектамина 2000 реагента.
3. Выдержите смесь в течение 20 мин при комнатной температуре, чтобы ДНК-липофектамина комплексов форме.
4. Удалите среду НЕК 293FT клеток, заменить его тщательно 7 мл среды (без антибиотиков) и добавить ДНК-липофектамина смесь в колбу и рок вперед и назад для смешивания (день 2). Инкубируйте колбу в течение ночи при 37 ° C в увлажненной 5% CO ₂ инкубаторе.
5. Изменение средней на следующий день (10 мл среды без антибиотиков; день 3).
6. После 48 часов (день 5) сбор супернатанта, центрифуги при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре и супернатант фильтруют через 0,45 мкм фильтр PVDF.

Культура средний - DMEM (НЕК 293FT)

палатка "> DMEM
10% FBS
0,1 ммоль MEM NEAA
6 мМ L-глутамина
1 мМ пирувата натрия MEM
1% Pen-Strep (опционально)
500 мкг / мл генетицина (опционально)

3. Вирус концентрации полиэтиленгликоля (PEG) осадков

1. Добавить одном томе полиэтиленгликоля раствор (50 мМ полиэтиленгликоля, 41 мМ NaCl, автоклав, рН = 7,2; PEG) в четырех томах супернатант и инкубировать в течение 2 часов при температуре 4 ° C. Тщательно смешайте его каждые 20-30 мин обращением.
2. Спином вниз при 1500 х г в течение 30 мин при 4 ° C. Белые гранулы должны быть видны.
3. Аспирируйте супернатант и снова центрифугируют при 1500 х г в течение 5 мин при 4 ° C. Аспирируйте оставшийся раствор PEG.
4. Ресуспендируют гранул в средней или фосфатно-солевом буфере (PBS) с помощью пипетки вверх и вниз и энергично вихрь в течение 20 до 30 секунд. В качестве ориентира использовать 500 мкл в течение одного T75 колбы и аликвоты ее до 100 мкл. Храните вирус при температуре -80 ° C.

4. Titering из Вирус

1. Семенной из 5 × 10 ⁴ U2-OS клеток в каждую лунку 6-луночный планшет за день до трансфекции.
2. В день трансфекции удаления культуральной среды и заменить его на 1 мл DMEM, содержащей 8 мкг / мл полибрен (hexadimethrine бромид). Развести концентрированный вирус супернатант 1:10 и 1:100 и добавить 1 мкл на одну лунку. Для более высоких концентрациях вируса использовать 1 мкл, 5 мкл и 10 мкл концентрированного супернатанта вирус для остальных скважин. Одна скважина остается в качестве положительного контроля.
3. На следующий день заменить средой 2 мл DMEM.
4. Начните с выбора на следующий день. Применить 10 мкг / мл бластицидин на каждой лунке. Заменить среде, содержащей антибиотик каждый второй день.
5. Примерно через 6-7 дней после начала отбора untransduced клетки мертвы. Для окрашивания мыть клетки три раза PBS и покрывают клетки с кристаллическим фиолетовым (10 мг / л кристаллический фиолетовыйВ 20% этанола) и инкубировать в течение 5-10 мин при комнатной температуре. Аспирата кристаллический фиолетовый (может быть повторно использован несколько раз) и промыть лунки дважды DDH ₂ O и высушить тарелки.
6. Подсчет колоний и умножить на 1.000 и соответствующие разбавления (рис. 7). Эта процедура позволяет рассчитать трансфекции единиц (ТУ) вируса / мл.

Культура средний - DMEM (HFF-2/U2-OS)

DMEM
10% FBS
6мм L-глютамин
1% Pen-Strep

5. Transduction человека диплоидных фибробластов (Эта процедура может быть использована для любого типа клеток).

1. Семенной из 5 × 10 ⁴ человека диплоидных фибробластов (HDFS) в 6-луночные планшеты за день до трансдукции.
2. Используйте множественности заражения двух вместе с 8 мкг / мл полибрен как трансдукции усилителя в общей сложности один миллилитр.
3. Изменение средней на следующий день.
4. КогдаКлетки на 70-80% слияния начала отбор с 10 мкг / мл бластицидин. После того, как выбор сделан (не более нетрансфицированных клетки погибают) расширение клетки могут начать и клетки готовы к экспериментам. Хронический выделение бластицидин позволяет генерировать стабильные линии клеток гиперэкспрессией GFP-DGN или GFP-dgnFS слитые белки, готовые для измерения активности протеасом. Эта процедура гарантирует очень высокую эффективность трансфекции зависит от типа клеток.

6. Измерение с помощью проточной цитометрии

1. Семенной из 1 × 10 ⁵ клеток (балансовая или GFP-DGN или GFP-dgnFS) за день до начала эксперимента.
2. Лечить контрольных клетках 3 часа до измерения с ингибитором протеасом, например, 100 мкг / мл LLNL.
3. Мыть два раза с PBS и урожай клеток с использованием 0,5 мл трипсина. Чтобы остановить trypsinisation использовать 4,5 мл культуральной среде и передать клеток в 15 мл сокола.
4. Спин тОн клетки при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
5. Аспирируйте среды, ресуспендирования клеток в PBS и спином вниз на 300 мкг в течение 5 мин при 37 ° C.
6. Аспирируйте PBS, ресуспендируют в 400 мкл FACS буфера (10 мМ Hepes, 140 мМ NaCl, 2,5 мМ CaCl _2, рН = 7,4) и передать клеток в трубах FACS.
7. Держите клетки на льду и меры образцов методом проточной цитометрии. Клетки не должны храниться дольше, чем 30 минут при 4 ° C.

7. Представитель Результаты

GFP-DGN гибридный белок несет в себе последовательность, которая предназначена для протеасомы и, следовательно, белок сразу деградировали, что соответствует уменьшению сигнала флуоресценции GFP. Рамки мутант (GFP-dgnFS) несет мутировавшие версии этой последовательности и не разлагается под протеасомы, это приводит к более высокому зеленую флуоресценцию. По этим причинам, молодые HDFS с ожидаемой высокой активности протеасом и трансдуцированных GFP-DGп показывает низкий (6% позитивных клеток) флуоресцентного сигнала в обоих измерений проточной цитометрии и в эпифлуоресцентной (рис. 2A и B, рисунок 3). То же самое HDFS трансдуцированных GFP-dgnFS отображать 39,7% положительных клеток. Обработка клеток с ингибитором протеасом LLNL (N-ацетил-L-лейцил-L-лейцил-L-norleucinal) поднял сигнал максимума 62,9% в обоих, GFP-DGN и GFP-dgnFS клеток (рис. 2A и B ).

Для определения возможного снижения активности протеасом в возрасте образцов человеческой кожи, кожных фибробластов изолированы от молодых, среднего возраста и старых доноров были инфицированы GFP-DGN и GFP-dgnFS, как описано выше и культивируется на тот же номер проход перед анализом методом проточной цитометрии. В этих опытах, четко увеличение GFP сигнала между молодых людей (11,2 ± 0,88% GFP-положительных клеток) и среднего возраста доноров (20,4 ± 2,27% GFP-положительных клеток, P = 0,003) наблюдается, что свидетельствует о снижение протеиOme активности в образцах, полученных от доноров в возрасте ⁷ (рис. 4). Нет дальнейшее снижение активности протеасом наблюдается в фибробласты изолированы от старых особей (рис. 4). Интенсивность флуоресценции для GFP-dgnFS во всех случаях ~ 90% (данные не приводятся), что указывает на высокую эффективность трансфекции для трех различных возрастных групп.

Рисунок 1. GFP-DGN и GFP-dgnFS последовательности. Отображаемые 3'-конце GFP (зеленый) сайт множественного клонирования pEGFP-CL1 вектору (серый) и DGN / dgnFS последовательности (красный).

Рисунок 2. Проточной цитометрии анализа GFP-DGN и GFP-dgnFS человеческих диплоидных фибробластов. А. Молодые фибробласты крайней плоти человека (HFF-2) были инфицированы лентивирусов векторов, несущих зеленого флуоресцентного белка (GFP)-DGN гена или GFP-dgnFS (рамки) строится, как показано и проанализировано для флуоресцентного микроскопа с помощью проточной цитометрии (FACS Песнь II, Becton Dickinson). Там, где указано, клетки также рассматриваются в течение 3 часов с ингибитором протеасом N-ацетил-L-лейцил-L-лейцил-L-norleucinal (LLNL). Неинфицированных клеток были использованы в качестве контроля. Эксперименты проводили в трех повторах. B. Данные представителем трех независимых экспериментах. Цифры отражают количество GFP-положительных клеток. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 3. Флуоресцентного анализа микроскопии GFP-DGN и GFP-dgnFS HFF-2 клеток. Молодые HFF-2 были рассматриваться как показано на рисунке 2. В 9 дней после заражения, клетки Visualized с помощью флуоресцентной микроскопии и фазового контраста.

Рисунок 4. Изменения в активности протеасом в человеческое старение кожи. Фибробласты крайней плоти человека из девяти разных доноров в указанных возрастных группах были минимально расширен и инфицированных лентивирусные конструкций кодирующий GFP-DGN. В 9 дней после инфицирования клетки были проанализированы методом проточной цитометрии. Данные были получены на трех образцах в возрастной группе в двух экземплярах (± SE).

Рисунок 5. Экспериментальный подход. Custom-олиго-нуклеотидов для DGN и dgnFS клонируют в pEGFP-C1 вектор и вирусов производится для каждой конструкции использовании НЕК 293FT клеток. Титр вируса определяется. Клетки преобразуют с вирусом и расширена. После благоприятствования клетки анализируютдля флуоресцентного сигнала с помощью проточной цитометрии.

Рисунок 6. Карта Plenti GFP-DGN. Карту pLenti6/V5-DEST вектор в том числе GFP-DGN отображается последовательность. Сокращения: PCMV (CMV промотор), GFP-DGN (последовательность GFP-DGN), P _SV40 (ранний промотор SV40), Em7 (Em7 промоутер), бластицидин (бластицидин ген устойчивости), ΔU3 / 3'LTR (3'LTR с удалить U3 область), SV40 рА (SV40 сигнал полиаденилирования), ампициллин (Ампициллин ген устойчивости), PUC Ори (PUC происхождения), PRSV / 5'-ДКП (RSV / 5'-ДКП гибридный промотор), Ψ (ВИЧ-1 Ψ сигнал упаковки ), RRE (ВИЧ-1 Rev ответ элемент).

Рисунок 7. U2-OS titering пластины. U2-OS высевали на 6-луночный планшет и трансфицировали с различными концентрациями вируса (разведение 1/100 и 1/10, 1, 5 и 10 мкл сотрудничестваncentrated вирусного супернатанта). Одна скважина была использована в качестве нетрансфицированных управления (NT). После 6-7 дней, клетки окрашивали кристаллическим фиолетовым и сушат на воздухе.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Первые публикации с помощью зеленого флуоресцентного белка (GFP) в качестве репортера субстрат для убиквитин-протеасомной деятельность была опубликована в 2000 ^12. С тех пор, GFP стал распространенным инструментом для визуализации клеточной активности, особенно убиквитин-протеасомн?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге
pEGFP-C1 векторного	BD Bioscience Clontech	6084-1
pENTR направленности TOPO Cloning Kit	Invitrogen	K2400-20
pLenti6/V5 направленности TOPO Cloning Kit	Invitrogen	V496-10
Липофектамина 2000 Реагент	Invitrogen	11668019
DMEM	Сигма	D5546
PVDF фильтр (Rotilabo-Spritzenfilter)	Рот	P667.1
Полиэтиленгликоль	Сигма	P2139
NaCl	Merck	1.06404.1000
Фосфаты Дульбекко Buffered Салипе 1x (PBS)	Invitrogen	14190
hexadimethrine метила	Сигма	10,768-9
Бластицидин	Invitrogen	R21001
Кристаллический фиолетовый	Сигма	C3886
FACS труб	BD Biosciences
Пенициллина стрептомицин (Pen-Strep)	Invitrogen	15140130
L-глютамин 200 мМ	Invitrogen	25030024
Эмбриональной телячьей сыворотки (FBS)	Biochrom AG	S0115
MEM Номера для незаменимых аминокислот (NEAA) 100x	Invitrogen	11140035
MEM пируват натрия 100 мМ	Invitrogen	11360039
D-(+)-Глюкоза (45%)	Сигма	G8769
Генетицина	Invitrogen	11811023
CaCl2	Merck	C5080
Hepes	Сигма	H3375
Трипсина-EDTA (0,05%)	Invitrogen	25300054