Изображений Запах-Вызванные деятельности в мышь обонятельной луковице с помощью программы оптического отражения и флуоресценции Сигналы

Резюме

В этой статье представлены протоколы собственных оптических сигналов и изображений флавопротеидов аутофлюоресценция сигналы карту запахов вызывало деятельности на поверхности обонятельной луковицы у мышей.

Аннотация

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. Functional optical imaging techniques are advantageous to visualize the activation of these modules in sensory cortices with high spatial resolution. In this context, endogenous optical signals that arise from molecular mechanisms linked to neuroenergetics are valuable sources of contrast to record spatial maps of sensory stimuli over wide fields in the rodent brain.

Here, we present two techniques based on changes of endogenous optical properties of the brain tissue during activation. First the intrinsic optical signals (IOS) are produced by a local alteration in red light reflectance due to: (i) absorption by changes in blood oxygenation level and blood volume (ii) photon scattering. The use of in vivo IOS to record spatial maps started in the mid 1980's with the observation of optical maps of whisker barrels in the rat and the orientation columns in the cat visual cortex¹. IOS imaging of the surface of the rodent main olfactory bulb (OB) in response to odorants was later demonstrated by Larry Katz's group². The second approach relies on flavoprotein autofluorescence signals (FAS) due to changes in the redox state of these mitochondrial metabolic intermediates. More precisely, the technique is based on the green fluorescence due to oxidized state of flavoproteins when the tissue is excited with blue light. Although such signals were probably among the first fluorescent molecules recorded for the study of brain activity by the pioneer studies of Britton Chances and colleagues³, it was not until recently that they have been used for mapping of brain activation in vivo. FAS imaging was first applied to the somatosensory cortex in rodents in response to hindpaw stimulation by Katsuei Shibuki's group⁴.

The olfactory system is of central importance for the survival of the vast majority of living species because it allows efficient detection and identification of chemical substances in the environment (food, predators). The OB is the first relay of olfactory information processing in the brain. It receives afferent projections from the olfactory primary sensory neurons that detect volatile odorant molecules. Each sensory neuron expresses only one type of odorant receptor and neurons carrying the same type of receptor send their nerve processes to the same well-defined microregions of ˜100μm³ constituted of discrete neuropil, the olfactory glomerulus (Fig. 1). In the last decade, IOS imaging has fostered the functional exploration of the OB^{5, 6, 7} which has become one of the most studied sensory structures. The mapping of OB activity with FAS imaging has not been performed yet.

Here, we show the successive steps of an efficient protocol for IOS and FAS imaging to map odor-evoked activities in the mouse OB.

протокол

1. Подготовка животных для работы с изображениями (в соответствии с Европейскими рекомендациями по уходу и использованию лабораторных животных, 86/609/EEC Директива)

1. От 6 до 8 недель C57BL6 самцов мышей анестезируют смесью кетамина (10mg/kg) и ксилазина (100mg/kg) вводят intraperitonealy. Операция начинается тогда, когда мышь не реагирует на hindpaw крайнем случае. Во время всего эксперимента животное помещается на грелку. Температура тела постоянно контролируется и поддерживается на уровне 37 ° C. Глубина анестезии сохраняется в течение хирургии и обработки изображений сессии, проверяя отсутствие конечностей уйти. Подкожного введения 20% от первоначальной коктейль анестетик вводят в противном случае.
2. Использование ножницы, удалите волосы с головы. Чистая открытые участки кожи от остаточных волос с помощью стерильной марлей, смоченной физиологическим раствором.
3. Место мыши в стереотаксической раме. Морда должна быть в той же плоскости, в затылок,для того, чтобы установить на поверхности обонятельной луковицы к горизонтали. Безопасные твердо уха и носа баров, чтобы предотвратить движение во время съемки.
4. Применение глазной мази на глаза животного, чтобы предотвратить высыхание и боль.
5. Лечить все хирургические инструменты с 70 ° и этанола области скальпа с последовательными взмахов бетадин.
6. Для удаления кожного покрова черепа, сначала составьте разрез в коже с ножницами в задней части головы между ушами. Затем вырежьте в обе стороны к основанию уха и в передне-заднем направлении в сторону лба вдоль век. Готово удаления кожи головы за счет сокращения кожи на верхней части морды близко к носу бар.
7. Под бинокулярным наблюдением, использовать ватный тампон, пропитанный солевым аккуратно отделить надкостницы на верхней части черепа. Используйте пару щипцов, чтобы удалить оставшиеся ткани и очистить поверхности черепа с помощью скальпеля, чтобы иметь чистую подготовки.
8. ОВ симметричная структура, состоящая из двух hemibulbs, которые расположены между веками. Они ограничены в ростральной и в каудальном направлении от венозного синуса, и разделенных сагиттального шва. Поместите лист желатина рассасывающиеся губки пропитанной дистиллированной воды на кости выше OB. Важно, чтобы эта кость области влажной в течение всего эксперимента.

2. Подготовка черепной окно

1. Удалить желатин губку и начните, мягко очищая кости с № 10 лезвие скальпеля. Держите под постоянным углом 45 ° между лезвием и кости, и двигаться лезвие от века, чтобы сагиттальной стороны лампочка области. Не применять вертикальное давление на кость или поцарапать кости выше венозного синуса.
2. Во время прореживания процесс, остановить каждые 5 минут и место гидратированных желатин губку на кости, чтобы остыть подготовки. Тампон череп с губкой для удаления остатков костной ткани.
3. Держите подметание иохлаждение альтернативно до визуализации трабекул, губчатый слой кости. Штрафа сосудистой из OB должен быть виден на данном этапе. Стоп царапин кости, и начать работу с кончика скальпеля в перпендикулярно "рисовать" прямоугольную область ограждающих OB. На этом этапе N ° 11 лезвие скальпеля может быть использован. Держите операции в пределах венозных синусов, которые должны быть в безопасности от любой скальпель инсульта.
4. Dig постепенно формируются прямоугольные траншеи с помощью последовательных движений скальпелем. Протрите кончик скальпеля периодически чистить его и хранить его острым. Будьте предельно осторожны глубине наконечником, не прикасаясь к поверхности оболочки.
5. Для того, чтобы получить представление о толщине оставшиеся кости, нажмите на нее осторожно кончиком пару щипцов. Если костный лоскут складки под давлением, переходим к следующему шагу.
6. Под каплю физиологического раствора, использование кончика скальпеля ориентирован горизонтально, чтобы поднять костный лоскут. Удаление лоскута должно быть сделано сarefully, чтобы избежать отрыва оставшиеся кости.
7. Как только поверхность Оби подвергается, проверьте на отсутствие каких-либо кровотечений или анастомоза сосудов. Повреждение оболочки или поверхности ткани снизит шансы на получение оптических сигналов. Протрите область с желатином губкой пропитанной солевым для того, чтобы держать лампу влажной.
8. Применить полиакрилат стоматологического цемента в форме хорошо на кости вокруг окна.
9. Место капли низкой температурой плавления агарозы (1,2%) по сравнению с твердой мозговой оболочки, и положить стерильную стеклянную крышку на размеры окна. Во время сессии изображений, малое количество агарозы может быть добавлен, чтобы компенсировать высыхания. Агарозном помешает О.Б. от движущихся с дыханием и обеспечит ровную поверхность для оптических изображений.

3. Оптическая установка изображений для отображения активности обонятельных

1. Обонятельная стимуляция должна быть точно определена во времени и интенсивности использования ольфактометра. Мы используем пользовательские модифицированную версию multivial перфузии системы Valvebank 8II от Автоматизация научно связанные с основным воздушным компрессором (сжатым воздухом дышать было бы подходит, а). Эта система позволяет точно и быстро внешнего регулирующего клапана. Решения чистого одоранта разводят в минеральном масле при выбранной концентрации. Для активации спинной О.Б. альдегиды, такие как гексаналь обычно используются. Точный объем разреженных одоранта (от 20 до 50 мкл) загружается на фильтровальную бумагу и помещают в шприц водохранилище. С помощью системы перфузии, давления контролируемой воздух поступает в систему, обеспечивая постоянную скорость потока воздуха одоризованный доставки животного нос во время открытия клапана. Одоранта поставляется через Tygon R-3603 Вакуумный труб (Saint-Gobain Corporation) проведение воздуха при расходе ~ 1000ml/min. Избегайте загрязнения между отдушки и остаточные количества одоранта в трубку. Если есть возможность, воспроизводимость одоранта стимул может быть противоречивыеlled с помощью пламенно-ионизационного детектора (microFID 2020 Photovac).
2. Оптической схемы включен. Она состоит из охлажденного чересстрочной 12 бит CCD камера (ORCA AG Хамамацу), связанные с флуоресценции стереомикроскопа (Leica MZ16), управляемый компьютером ольфактометра и стабилизировался возбуждения ламп с соответствующими фильтрами вмешательства полосовой. Схема, описывающая нашей установки обеспечивается на рисунке 2. Для внутренних оптических сигналов Imaging (IOSI), 200 Вт галогенной лампы вольфрам (Oriel QTH) в сочетании с волокном световое кольцо (Schott) подключен вокруг объектива микроскопа используются, чтобы обеспечить стабильное и равномерное освещение. Для флавопротеидом аутофлюоресценция Сигналы Imaging (Роснаукой), 150 Вт металлогалогенные лампы (Leica) с 5 мм руководство жидкость светло-ядро обеспечить даже локализованные возбуждения флуоресценции через эпи-подсветкой порт стереомикроскопа.

   Приобретение изображения и аппаратное обеспечение синхронизации реализуются заказного программного обеспечения. Открытаяource программного обеспечения микроменеджер также может быть использован для управления оптическими установки и приобретения.

4. Оптические изображения

1. Место стереотаксической рамы под стереомикроскопа, черепно окно по центру поля зрения (см. рис. 2A для Схема оптической схемы).
2. Tune микроскоп, чтобы сосредоточиться на капилляры. До стимуляции испытаний (см. описание в 5) образ лампы взят под 560nm (зеленый) свет (ВКИ), которая обеспечивает хорошую контрастность для получения изображений кровеносных сосудов. Эта картина используется в качестве анатомического контроль и проверить состояние подготовки и приобретает несколько раз в течение эксперимента.
3. Для IOS изображения, интенсивность отраженного света регистрируется с помощью ПЗС-камеры при 630 + / -10 нм (красный) подсветки. Изображения, полученные в полный кадр (без биннинга) со скоростью 5 кадров в секунду, что соответствует времени экспозиции около 150 мс. Мощность источника света регулируется повторно Ах оттенков серого, по крайней мере ~ 3000 на площади О.Б., близкой к насыщению ПЗС пикселей скважин. Это позволяет воспользоваться 12bits динамика CCD для захвата слабого изменения интенсивности во время активации. Максимальная IOS амплитуды достигает ~ 1%.
4. Для ФАС изображений флуоресценции, приобретенных по возбуждению 480nm + /-20нм (синий) epiflurorescence света. Фильтр верхних частот на 515nm настроен для захвата света. Изображения, полученные в 5 кадров в секунду с биннинга из 4 на 4, чтобы максимизировать чувствительности. Мощности возбуждающего света настраивается аналогично IOS с серым уровнем 3000 на площади OB. Максимальная ФАС амплитуды достигают ~ 3%.

   Для обоих изображений условий, глубины резкости в теме плоскости же и измерялась в 0,5 мм для увеличения примерно в 4 раза.

5. Свет должен быть отключен от визуализации испытаний, чтобы избежать нагрева и фотообесцвечивания препарата.

ле "> 5. изображений испытаний

1. Стандартный сеанс визуализации включены базовые от 5 до 10 с, где только воздух подается, а затем запах стимуляции от 3 ​​до 10 с в зависимости от выбранного запаха концентрации, и от 70 до 82S далее записанные с постоянным расходом воздуха для базового восстановления (рис. 2А). В конце судебного разбирательства, свет выключен, а чистый воздух подается по продолжительности интервала между суда (от 1 до 3 минут), чтобы смыть остаточные молекулы запаха и избежать сенсорного привыкания. Запах испытания чередуются с пустыми испытания (подача воздуха).
2. Запах-вызывало активированный зон визуализируются как приблизительно сферических областей на картах и соответствовать размеру отдельных клубочков (от 80 до 200 мкм в диаметре ^9). Обработка изображений объясняется на рисунке 2B. Обонятельные карты представлены на рисунке 3. В отличие от любой другой сенсорной системы, отношение сигнал-шум в ОВ было достаточно, чтобы решать запах вызывал реакции в одном испытаний (Рис. 3B для IOS и рис. 3D для ФАС).
3. Мыши эвтаназии сразу же в конце сессии изображений с использованием методов в соответствии с Европейскими рекомендациями по уходу и использованию лабораторных животных.

6. Представитель Результаты (см. обонятельных карты на рисунке 3):

Рисунок 1 Структурная организация основной обонятельной луковицы у грызунов. Обонятельные сенсорные нейроны, первичных сенсорных клеток, расположенных в основной обонятельный эпителий, экспресс же рецепторов одоранта и сходятся на том же клубочков в OB. Обонятельные клубочков, круглые neuropils (пунктирные кружки), расположены на поверхности OB. Обратите внимание, что очень плотная и сложная сосудистая сеть присутствует в клубочковой уровне. Сокращения (верх / вниз): ONL: обонятельный нерв слой; GL: клубочкового слоя, EPL: внешний слой плексиформные; MCL:митрального слоя клеток; GCL: ЗК слоя.

Рисунок 2 отражения и флуоресценции сигналы записи в естественных условиях. А. Широкие поля установки оптических изображений. Мозг мыши анестезии подвергается либо красный (IOS) или синий (ФАС) свет или через кольцевой волокна придает объектив оптика или эпи-подсветкой порт микроскопа. Запахи загружаются в запечатанных флаконах и одоризованный воздух поступает к животному нос (зеленый свет: открыть клапан). Б. Запись протокола и обработки данных. IOS и ФАС регистрируются в качестве серии отдельных исследований (90-е годы продолжительность). Диаграмма показывает хронологию одного судебного разбирательства: базовый колеблется от 5 до 10 с, стимуляцию от 3 до 10 секунд, и вернуться к исходной линии, от 70 до 82S. Обработка изображений требует пиксель на пиксель вычитания значений интенсивности в течение базового для значений интенсивности в период стимуляции (ФАС) оГ стимуляции плюс возвращение к исходному (для IOS). Эта разница делится на базовые значения для получения изменения в% (см. полученных изображений на рис. 3).

Рисунок 3 дезодорированный вызванной активности карты в OB использованием IOS и ФАС изображений. А. сосудистой спинного О.Б. визуализированы в зеленом свете. До нашей эры. IOS образ (одно судебное разбирательство против трех усредненных испытаний соответственно) для 10 с презентацией на 20% гексаналь. Белые стрелки указывают сферической регионах, представляющих интерес активируется этим запахом. Эти активации карты были получены с использованием кадров усредненная в течение первой секунды после окончания запах стимуляции (максимум отражения изменения -0,63% в и -0,52% в В). Обратите внимание на черные зоны, где поглощение запаха активации не произошло. Компакт-диск. ФАС приобрела последовательно в той же мыши по той же одоранта (один судебный процесс против трех усредненных соответствующих испытанийлы). Эти активации карты были получены с использованием кадров усредненная в течение первой секунды после начала стимуляции запах (максимум флуоресценции изменения 0,72% в D и 0,66% в Е). Обратите внимание, что белый зон аутофлюоресценция выбросов показано черными стрелками соответствуют черные зоны в IOS. Зернистым аспект увидеть в карте ФАС в связи с 4 на 4 биннинга, необходимых для улучшения чувствительности. ФАС изображения не были устранены от аутофлюоресценция отбеливания. Фактические размеры изображения Берни Экклстоун: 0,7 мм х 1,2 мм.

Обсуждение

В этой статье мы представляем IOS и ФАС методов визуализации для прижизненного записи запах вызывал деятельности в OB мыши. Для достижения этой цели относительно простой и доступный широким полем оптической схемы изображений не требуется. Приобретение визуализации данных требует подготовки для выполнения тонких хирургических процедур и избегать любых повреждений оболочки или ткани головного мозга. В частности, кровотечений будут поглощать фотоны записал для работы с изображениями и в конечном итоге эксперимент.

Одним из преимуществ IOS и ФАС изображения, чтобы избежать введения флуоресцентных индикаторов, которые могли бы привести к сотовой токсичность или нежелательные побочные эффекты. Они позволяют решать вопросы о обонятельных карты таким образом пространственное кодирование сенсорных стимулов. В отличие от 2-дезоксиглюкозы изображений, они предоставляют возможность изображения несколько запахов в одно животное. Однако, так как фотон проникновения ограничен в ткани, IOS и ФАС ограничены спинной части О.Б.и не может быть записан с вентральной области.

Эндогенные оптических изображений сигнала предлагает отличные пространственного разрешения для изображений в естественных условиях. Технические озабоченность улучшения количественных расчетов сосудистых компонентов отражения сигналов ^8,9, а также динамика оксигенации крови и объема при сенсорной активации ^10. Многоволновые изображений IOS подходы визуализации в настоящее время в нашей лаборатории в полной мере количественно общей концентрации гемоглобина и кислорода в О. Б. во время сенсорных активации. Эти спектроскопические измерения оптической добавил в ФАС изображений даст возможность ответить на нерешенные взаимоотношения между сосудистыми и внутриклеточной динамики в процессе активации сенсорной ^11,12.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название Regent	Компания	Номер по каталогу
Imalgene	Merial
Rompun	Bayer
Агарозы, тип III-	Sigma-Aldrich	A9793-50G
Гексаналь 98%	Aldrich	115 606-100мл