Производство и Titering рекомбинантных адено-ассоциированные вирусные векторы

Резюме

Рекомбинантный адено-связанный вирус (rAAVs) векторов, становятся все более ценными для В естественных условиях Исследования на животных. Мы опишем, как rAAVs могут быть произведены в лаборатории, и как эти векторы могут быть оттитрованы, чтобы дать точное считывание количества инфекционных частиц.

Аннотация

В последние годы рекомбинантный адено-ассоциированные вирусные векторы (AAV) становятся все более ценными для прижизненного исследования на животных, а также в настоящее время проходит испытания в клинические испытания на человеке. Дикого типа AAV является непатогенных члена семьи parvoviridae и по своей сути репликации с дефицитом. Широкого профиля трансдукции, низкий иммунный ответ, а также сильных и устойчивых экспрессии трансгена достигнуты с этими векторами сделало их популярными и универсальный инструмент для в пробирке и в естественных условиях доставки гена. rAAVs можно легко и дешево производится в лаборатории, и, основываясь на их благоприятный профиль безопасности, которые обычно предоставляются низкой классификации безопасности. Здесь мы опишем метод производства и titering химерных rAAVs содержащие белки капсида, так и AAV1 AAV2. Использование этих так называемых химерного вектора сочетает в себе преимущества обоих родительских серотипов, таких как высокие запасы титры (AAV1) и очисткис помощью аффинной хроматографии (AAV2). Эти AAV серотипов являются наиболее изученным из всех серотипов AAV, и в индивидуальном порядке имеют широкую картину инфекционности. Химерного вектора, описанные здесь, должны иметь инфекционные свойства AAV1 и AAV2 и, таким образом, можно ожидать, чтобы заразить широкий спектр тканей, включая нейроны, скелетных мышцах, поджелудочной железы, почек и других. Метод, описанный здесь используется гепарин очистки колонки, метод считается, дают более высокий титр вирусных и чище вирусных подготовки, чем другие методы очистки, такие как центрифугирование через цезия градиентом хлорида. Кроме того, мы опишем, как эти векторы могут быть быстро и легко оттитрованы, чтобы дать точное считывание количества инфекционных частиц.

протокол

См. рисунок 1 для иллюстрации обобщения следующий протокол.

Безопасность Примечание: Все материалы, которые были в контакте с собранном вирусных частиц необходимо дезинфицировать раствором Virkon или других подходящих дезинфицирующих средств.

1. Подготовка запасов плазмида ДНК (~ 2 дня)

1. Следующие плазмиды требуется ^1:
   • pRV1 - содержащие AAV2 Rep и Кап последовательности
   • pH21 - содержащие AAV1 Rep и Кап последовательности
   • pFdelta6 - аденовирус-хелперов плазмиды
   • AAV плазмиды, содержащей рекомбинантный кассеты выражение окружении AAV2 упаковки сигналы (в виде перевернутого концевых повторов, РМЭ)
2. Хотя pFdelta6 должны быть выращены в Stbl2 компетентных клеток, чтобы предотвратить частичное удаление, pRV1 и pH21 могут быть выращены в DH5alpha компетентных клеток. AAV плазмиды могут быть выращены в Stbl2 клеток, если частичное удаление происходят в клетках DH5alpha.
3. ДНК плазмиды должны быть высокого качества и свободным от загрязнений РНК. Плазмиды могут быть проверены на целостность, используя следующий дайджестов:
   • pRV1 - дайджест с XbaI дать полосы 7,5 кб и 3,8 кб
   • pH21 - дайджест с EcoRI дать полосы 4,5 кб, 2,8 кб и 0,2 кб
   • pFdelta6 - дайджест с HindIII дать полосы 5,5 кб, 3 кб, 3 кб, 2,3 кб и 1,5 кб

2. Подготовка человеческих эмбриональных клетках почек 293 (HEK293) для трансфекции (2 - 3 дней)

1. Пластина два 80% сливной 150 см ² колбы НЕК293 на пять 15 см в диаметре блюда Nunc тканевой культуры. Клетки должны быть 70 - 80% сливной до трансфекции (примерно через 48 часов после покрытия). Культуры клеток в изменение стандартного Eagle Дульбекко среде (DMEM) с низким уровнем глюкозы, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 100 Ед / мл пенициллина / 100 мкг / мл стрептомицина.
2. За 3 часа до трансфекции удалить DMEM и заменить Айскоув"Среды с изменение Дульбеко (IMDM), содержащий 5% эмбриональной телячьей сыворотки.

3. Трансфекция вирусных плазмид (~ 1 час для трансфекции, 3 дня инкубации)

1. Подготовка следующих за одну партию (5 х 15 см пластины культуре ткани) вируса:
   • 62,5 мкг плазмиды AAV
   • 125 мкг pFdelta6
   • 31,25 мкг pRV1
   • 31,25 мкг pH21
   • 1650 мкл 2,5 М CaCl ₂
   • 12 мл дН ₂ O
2. В классе 2 культуре ткани капот стерильный фильтр трансфекции смесь в 50 мл трубки.
3. В то время вортексе решение, быстро добавить 13 мл 2 HEPES х буферном растворе (рН = 7,05). Замените крышку 50 мл трубку и продолжают вихрь в течение 15 секунд. Оставить постоять в течение 1 минуты 45 секунд, мелкий белый осадок должен форме.
4. Аккуратно добавить 5 мл трансфекции раствора в каждую 15 см блюдо культуры ткани. Swirl пластин для смешивания и вернуться в инкубаторе.
5. 16 часов после трансфекции удалить IMDM средних и заменить DMEM.

4. Лизирующий клеток и уборки rAAVs (2 часа)

1. Через 72 часа после трансфекции, удалить СМИ из пластин культуре клеток и выбросьте. Все отходы следует относиться с решением Virkon или других подходящих дезинфицирующих средств.
2. Осторожно промыть клетки в теплой 1x фосфатным буферным раствором (PBS, рН 7,4).
3. Добавить 25 мл теплой PBS в каждую тарелку и аккуратно удалить соты с ячейкой скребком. Сбор суспензии в 50 мл пробирки.
4. Гранул клетки при 800 мкг в течение 10 минут.
5. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 150 мМ NaCl, 20 мМ Трис рН 8,0, использовать 10 мл на ткани пластины культуры. Разделение на две 50 мл пробирки.
6. Подготовка свежий раствор 10% натрия дезоксихолата в дН ₂ O. Добавить 1,25 мл этого в каждую пробирку для конечной концентрации 0,5%. Добавить benzonase нуклеазы до конечной концентрации 50 единиц на мл. Смешайте трубки тщательно.
Инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа.
7. Удалить распада клеток путем центрифугирования при 3000 мкг в течение 15 минут. Трансфер в свежем 50 мл трубки, убедитесь, что все ячейки мусор был удален, чтобы предотвратить блокирование гепарин столбцов (см. шаг 5). На этом этапе образцы могут храниться при температуре -20 ° C, прежде чем продолжить. У нас хранятся образцы в течение нескольких недель при температуре -20 ° С без снижения инфективности.

5. Гепарин очистки колонке rAAVs (2 - 3 часа)

1. Установка HiTrap гепарин столбцов с помощью перистальтического насоса так, что решения проходят через колонку на 1 мл в минуту для шагов 5,2 до 5,4. Важно, чтобы убедиться в отсутствии пузырьков воздуха вводятся в колонку гепарин.
2. Равновесие колонку с 10 мл 150 мМ NaCl, 20 мМ Трис, рН 8,0.
3. Применить 50 мл вируса решение колонки и дать течь через.
4. Промыть колонку с 20 мл 100 мМ NaCl, 20 мМ Трис, рН 8,0.
5. Использование 5 мл шприц продолжают мыть колонке Wго по 1 мл 200 мМ NaCl, 20 мМ Трис, рН 8,0, затем по 1 мл 300 мМ NaCl, 20 мМ Трис, рН 8,0. Отменить проточные.
6. Использование 5 мл шприцев и нежный элюировать давление вируса из колонки, применяя:
   • 1,5 мл 400 мМ NaCl, 20 мМ Трис, рН 8,0
   • 3,0 мл 450 мМ NaCl, 20 мМ Трис, рН 8,0
   • 1,5 мл 500 мМ NaCl, 20 мМ Трис, рН 8,0
   • Сбор этих в 15 мл центрифужную пробирку.

6. Концентрация и стерильной фильтрации rAAVs (1 час)

1. Концентрат вектора, используя Amicon ультра-4 центробежного фильтра с единицы 100000 молекулярного веса отсечки. Нагрузка 4 мл элюата колонки в концентратор и центрифуге при 2000 мкг в течение 2 минут (при комнатной температуре). Отменить flowthrough и перезагрузите концентратор с оставшийся раствор вируса и повторить центрифугирования. Концентрированный объем должен быть примерно 250 мкл. Если концентрированный объем значительно больше, чем это, отказаться от потока тhrough и продолжают центрифуги в минуту действия, пока объем составляет примерно 250 мкл.
2. Добавить 250 мкл PBS, чтобы вирус для конечного объема 500 мкл и удалить из концентратора.
3. Фильтры вектора через 13 мм диаметром 0,2 мкм фильтр шприца. Векторные должны быть аликвоты и хранили при температуре -80 ° C до требуется.

7. Titering вирусных акций (3 дня)

Для этого требуется промоутер, который является активным в НЕК293 вождения гена репортера или immunocytochemically обнаружить генный продукт. При производстве вектор, который не совместим с НЕК293 других клеточных линий или первичных культур клеток могут быть использованы.

1. Подготовка 18 поли-L-лизин покрытием покровные стекла или 18 скважин слайдов Nunc камеры путем посева НЕК293, чтобы они были 40 - 50% вырожденная. Для титрования Cre-зависимых rAAVs использовать НЕК293, что стабильно выразить Cre рекомбиназы ^2.
2. Infect каждой лунки с серийными гilutions из AAV вектор (рис. 2A). Используйте 3 скважин в разведении. Мы регулярно добавлять вирус непосредственно в каждую лунку.
3. После 72 часов исправить HEK293, добавив равный объем 4% параформальдегида (PFA) и средних (предоставление конечной концентрации 2% PFA) в течение десяти минут при комнатной температуре.
4. Вымойте ячейки три раза PBS, промыть в дН ₂ O и покровное.
5. Подсчитайте количество трансдуцированных клеток из трех скважин, которые имеют высокий коэффициент разбавления, но по-прежнему содержат инфицированные клетки, найти среднее значение этих и умножить на коэффициент разбавления, чтобы дать число инфекционных единиц на микролитр (рис. 2В).

8. Ожидаемые результаты

НЕК293 трансдуцированных с вирусом кодирование расширенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP) показаны на рисунке 2B. Как правило, мы добиться согласованных титры примерно 6 х 10 ⁶ инфекционных частиц в микро-литра. Мы регулярно использовать эти векторы для стереотаксической Инджеction на взрослом мозге грызунов. Это обеспечивает мощную технику для конкретного региона экспрессии генов ^2. Для объединения этого региона с специфика камерного типа селективной экспрессии генов мы вводим Cre рекомбиназы-зависимых rAAVs в целевых регионах Cre-трансгенных мышей ^2. Рис 2С-Е приведены примеры стереотаксической инъекции Cre-зависимых rAAVs кодирования EGFP в различных регионах мозга взрослого парвальбумина-Cre трансгенных мышах ^3.

Рисунок 1. Схематическое изображение протокол для производства rAAV. 1.) НЕК293 высевают и выросли до 70 - 80% слияния. 2.) AAV и помощником плазмид готовятся и трансфицировали в НЕК293. 3.) Средний изменяется обратно на DMEM 16 часов после трансфекции и HEK293 клетки культивировали в течение еще 56 часов. 4.) HEK293 клетки собирают и разрушается. rAAV векторов отделены от клетки мусора на сentrifugation. 5.) Вирусные частицы очищаются через гепарин колонки, прежде концентрации и стерилизации. 6.) HEK293 клетки, выращенные на 24 луночных планшетах и ​​заразить серийные разведения вектора AAV, чтобы определить число инфекционных единиц.

Рисунок 2. Titering и в естественных условиях применения rAAV1 / 2. (А) Настройка НЕК293 для измерения вирусного титра. HEK293 клетки трансдуцированных с серийные разведения rAAVs. С неинфицированных контроль, N 1 мкл неразбавленного вирусных акций. (B) HEK293 клетки, инфицированные rAAVs выражения EGFP. (CE) Вирусный выражение EGFP ограничивается Cre-экспрессирующих нейронов в различных регионах цель парвальбумина-Cre трансгенных мышей после стереотаксической инъекции Cre активированных rAAVs. Примеры изображения показывают GFP иммунореактивности в (С) бледного таламус и ретикулярную глобус, (D) зубчатой ​​извилине и (Е) СА1 области гиппокампа. Д.Г., де-ntate извилины; РТ, ретикулярные ядра таламуса; Г.П., бледного шара. Шкала бары: В, 500 мкм, C, 100 мкм, D, 100 мкм, Е, 500 мкм.

Обсуждение

rAAV векторы становятся все более ценными для прижизненного исследования на животных. Здесь мы описали простой и недорогой протокол для производства rAAVs, которые могут способствовать широкому применению этого полезного вектор, избегая дорогостоящих услуг сторонних вируса продукции компании. Протокол (на основе справочных 1) описывает производство химерных rAAV1 / 2 векторов, содержащих белки капсида от обоих родительских серотипов при равном соотношении ^4. Очистка rAAV векторов путем связывания с гепарином колонн опирается на выражение AAV2 капсид белков, но могут быть объединены с другими серотипами, чем AAV1 изложены здесь. Кроме того, AAV6, как сообщается, связываться с гепарином, хотя и с пониженным сродством, и потенциально может быть очищен с гепарином столбцов с помощью этой процедуры ^5,6. Следует отметить, однако, что другие серотипы потребует различных концентраций NaCl для элюирования колонки гепарин ^5,7.

Упаковка rAAV геномов было показано, что оптимальное между 4,1 и 4,9 кб с резким сокращением в упаковке КПД до 5,2 кб ^8. Эта упаковка предел может считаться крупнейшим недостатком системы rAAV, так как тип клеток-специфического регулирования экспрессии трансгена обычно достигается за счет большого цис-действующих элементов, которые не могут быть удовлетворены за счет мелких частиц AAV. Чтобы преодолеть низкий титр партий, например, в результате попытки пакета генов, которые близки к пределу AAV упаковки мы объединяем отдельные вирусные партиях сосредоточено до 250 мкл в 500 мкл одна партия, а не добавлять PBS как указано в пункте 6.3. Надежная камерного типа конкретных трансдукции может быть достигнуто за счет Cre-драйвера мыши и условных кассеты rAAV (см. ниже), чтобы избежать растяжения упаковки предела.

Следует отметить, что в то время как этот протокол попытки обеспечить легкий в следуйте инструкциям на производство высококачественных тИТЭР rAAV, он требует наличия AAV2 капсида фрагментов белка для очистки гепарин аффинной хроматографии. Серотипов, кроме AAV2 должна быть очищена с помощью альтернативных процедур ^9. Одним из преимуществ гепарин очистки столбец считается, производить AAV векторов, которые имеют большую инфекционности темпами, чем, полученной с использованием градиента цезия хлорид ^10. Тем не менее, Есть также некоторые недостатки этого метода. Например, другие белки, которые связывают гепарин может также присутствовать в очищенной вирусной акции. Хотя тропизм гепарин-очищенных векторы могут влиять на вектор титр ^10, наш подход к конкретно нацелены либо возбуждающих ²⁰ или тормозных нейронов (рис. 2) работает Cre-индуцированной активации AAV-опосредованной экспрессии трансгена и титр-независимыми. Альтернативу гепарину очистки колонка использование iodixanol градиента плотности, которая производит более высокий титр вирусных и чище, чем подготовка использованиецезия градиентом хлорида ^10. Этот метод может также сочетаться с гепарином очистки колонке для получения вектора, который больше, чем 99% чистого ^11. Таким образом, серьезное внимание должны быть приняты отдельными группами, какие вирусные метод очистки лучше всего подходит для их конкретных приложений вниз по течению.

Наиболее распространенные проблемы, связанные с этим протоколом низкий вирусный титр. По нашему опыту это, как правило, восходят к низкой эффективности трансфекции, или элюирования вируса из гепарин столбцов. Все трансфекции материалы должны быть при комнатной температуре до трансфекции, и проверить трансфекции должны быть выполнены, чтобы найти оптимальные условия в каждой лаборатории. Другие методы трансфекции, таких как lipofectamine, отличаются высокой эффективностью, но может быть слишком дорого. Кроме того, концентрации и рН гепарин решения элюирования колонка имеет решающее значение для полного вымывания вирионов из гепарина witho столбцовут повреждения. Еще одним важным моментом является то, что упаковка клетки должны хорошо прилипают к поверхности блюда тканевой культуры. Если клетки отделяются на определенном этапе во время процедуры рекомендуется прекратить эксперимент и размораживания новый флакон клеток.

Пространственно-временной контроль экспрессии трансгена у грызунов легко достигается точной ориентации анатомических и стадии развития животного. Эффективное AAV-опосредованного переноса генов было показано внутриутробно ^12,13. Во взрослом мозге, площадь инфицированных rAAV частиц после стереотаксической инъекции можно регулировать от очень маленьких целевых регионах, гораздо больших площадях не только изменениями в вирусном титре, но и путем изменения параметров впрыска. К ним относятся объем и скорость инъекции, а также включение полиола маннитол с вирусной суспензии ^14. Маннитол также может быть использован для повышения заражения различных тканей после системной инъекции rAAV ^{15 <}/ SUP>.

Упаковке мощностью rAAV (примерно 4,7 кб), вероятно, наиболее ограничивающим фактором с точки зрения генов, которые могут быть выражены в этих вирусных векторов. Однако, недавние исследования показали, что это может быть частично преодолены путем расщепления больших генов или выражение кассеты на отдельные векторы rAAV и введение моста последовательности, инициируя экспрессию генов, когда вирионы заразить той же клетке ^16. Выражение уровне генов, переносимых насекомыми, rAAV также может быть значительно повышена с помощью самостоятельного бесплатный rAAV векторов ^17. Стереотаксической инъекции векторов rAAV обеспечивает быстрый, недорогой и мощный метод для стимуляции экспрессии генов в регионе имеет свои особенности. В сочетании с ^2-го поколения стратегии РНК-интерференции ¹⁸ rAAVs также может быть использован для конкретного региона генов сбить. rAAVs могут быть объединены с Cre-трансгенных мышей или камерного типа конкретных промоутеров для достижения схемы и камерного типа-Специфическая экспрессия генов, позволяющих генетические манипуляции с высоким пространственным разрешением ^2,19-21, при монтаже rAAVs, например, с системой тет добавляет временной контроль над вирусом-опосредованной экспрессии генов ^22,23. Эти примеры иллюстрируют огромное комбинаторное потенциал этих векторов и прогнозировать быстрый рост rAAV основе исследований за долгие годы.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
Amicon Ультра центробежные фильтры	Millipore	UFC810024	100000 MWCO
Benzonase нуклеазы	Sigma-Aldrich	E1014
Dulbeco в модификации Eagle среды (DMEM)	Invitrogen	10567014	Дополнение с 10% FCS и 10 ед / мл penicillin/100 мкг / мл стрептомицина
НЕК293	Американский тип культуры коллекцию	CRL-1573	Использование при прохождении менее 30
HEPES буферном растворе	Sigma-Aldrich	51558
HiTrap Гепарин картридж	Сигма-Aldrich	54836
Искова изменение Дульбекко среда	Invitrogen	12440-053	Дополнение с 5% FCS
Натрий дезоксихолата	Sigma-Aldrich	D5670	Сделайте свежие решения для каждой партии
15 см блюда культуры ткани	Fisher Scientific	157150
Stbl2 компетентных клеток	Invitrogen	10268-019
Virkon решение	Fisher Scientific	NC9821357	Оставьте для дезинфекции ночь, прежде чем выбросить стечь