Электропорации черепно-лицевых Мезенхима

Резюме

Черепно-лицевые хрящи развиваться в тесном контакте с другими тканями, и их трудно манипулировать живыми животными. Мы используем электропорации доставить молекулярных инструментов в процессе роста черепно-лицевой скелет в обход раннего эмбрионального эффектов. Такой подход позволит нам эффективно теста кандидат молекул В естественных условиях.

Аннотация

Электропорация это эффективный метод доставки ДНК и других заряженных макромолекул в тканях в точные моменты времени и в точных местах. Например, электропорации был с большим успехом используются для изучения нервных и сетчатки развития Xenopus, курицы и мыши ^1-10. Тем не менее, важно отметить, что во всех этих исследований, следователи не была направлена ​​на мягких тканях. Потому что мы заинтересованы в черепно-лицевой развития, мы адаптировали метод целевой лица мезенхимы.

Когда мы искали литературу, мы обнаружили, к нашему удивлению, очень мало сообщений о успешной передачи генов в хрящевой ткани. Большинство из этих исследований были генной терапии исследований, таких как миРНК или белка доставки в хондрогенного клеточные линии, или, животных моделях артрита ^11-13. В других системах, например, курицы или мыши, электропорации лица мезенхимы был сложным (личные КОММУНИКАЦИИионов, кафедра черепно-лицевых развития, KCL). Мы предположили, что электропорации в procartilaginous и хрящевой тканей в Xenopus могли бы работать лучше. В наших исследованиях показано, что перенос генов в лице хрящей эффективно происходит на ранних этапах (28), когда зачаток лица по-прежнему состоит из мягких тканей до хряща дифференциации.

Xenopus является очень доступным позвоночных система для анализа черепно-лицевой области развития. Черепно-лицевых структур более видимым в Xenopus, чем в любой другой модели позвоночных, прежде всего потому Xenopus эмбрионы оплодотворяются внешне, позволяя анализ ранних стадиях, а также содействие живых изображений на одной резолюции клетки, а также повторное использование матери ^14. Среди позвоночных моделей развивающихся внешне, Xenopus более полезно для черепно-лицевой анализа, чем данио рерио, а Xenopus личинки крупнее и легче диssect и развивающихся лицевой области является более доступным для визуализации, чем эквивалентные региона в рыбе. Кроме того, Xenopus является эволюционно ближе к людям, чем данио рерио (~ 100 млн лет ближе) ^15. Наконец, на этих этапах, Xenopus головастики прозрачны, и одновременно выражение флуоресцентных белков или молекул позволит легко визуализации развивающихся хрящей. Мы ожидаем, что такой подход позволит нам быстро и эффективно теста кандидат молекул в модели системы в естественных условиях.

протокол

Часть 1A. Оборудование

Микроскоп: вертикально стерео-рассекает область с низкой цель власти

• Напряжение / Импульсный Генератор: BTX ECM 830 квадратных системы Электропорация волна
• Внесите съемник: P-87 микропипетки Puller (Саттер Instrument Company, CA)
• Манипулятор: грубый, или в сочетании грубой и тонкой в зависимости от препарата.
• Микропипетки держателя: тонкие инструменты науки
• Электрод: домашнее
• Электропорация камеры: домашнее

Г-образной формы электродов:

1. Вырезать 8 см высокочистого 0,4 мм вольфрамовой проволоки (Гудфеллоу) и прикрепить на середину 1 мл шприц использованием шпаклевки (мы используем Blu-Tack). Оставьте 4 см вольфрамовой проволоки подвергаются от кончика шприца и согнуть наконечник в L-формы, 1 см от края (рис. 1А).
2. Обрезать кончик так, чтобы конец мер 0,5 мм в длину. Тего кончик электрода конца.
3. Запуск избыток параллельно вольфрамовой проволоки в шприц и использовать его для подключения генератора электрод импульса.
4. Повторите процесс принятия пару электродов.
5. Прикрепить электроды квадратных генератор пульсовой волны через кабель постоянного тока.

Электропорация камеры

1. Линия нижней части 90 мм блюдо с ~ 5 мм нетоксичного пластилина.
2. Заполните блюдо с электропорации СМИ.
3. Использование № 5 щипцы часовой вырезать Т-образные скважины (рис. 2). Долго и должны измерять ~ 2 мм х 2 мм х 10 мм и короткие ~ 2 мм х 2 мм х 5 мм. Электропорация блюдо можно мыть и использовать повторно.

Часть 1В. Реагенты

ДНК или заряженных макромолекул

• Микропипетки: 1 мм шириной 4 "долго боросиликатного стекла капилляров (WPI, TW100-F)
• Культура СМИ: Нормальный амфибия Media (NAM)
• > 10 X складе: 1100 мм NaCl, 20мМ KCl, 10 мМ Ca (NO _{3) 2} • 4H ₂ O, 1 мМ ЭДТА.
  • Автоклав и хранить при температуре 4 ° C.
  • 1 X ДН: развести с 10x акции, буфер с 0,1 мМ NaHCO ₃ и 0,2 мМ Na ₃ PO _4.
• Xenopus laevis головастиков, этап 28

ДНК подготовки:

1. Подготовка выражение плазмид с использованием стандартных протоколов.
2. Ресуспендируют ДНК до конечной концентрации 1 мкг / мкл в нуклеазы свободного H ₂ 0.

* Мы имели успех с векторов, содержащих сильный промотор CMV, таких как pCS2 + [16]. Для линии анализа, мы обычно включают ДНК, кодирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP + pCS2) в конечной концентрации 0,1 мкг / мкл. [ДНК концентрации от 0,1-3 мкг / мкл были также проверены. Мы обнаружили, что концентрация ниже 0,8 мкг / мкл неэффективно меченых клеток, в то время как ДНК в концентрациях выше 2 мкг / м ищ л не улучшило эффективность электропорации].

Морфолино олигонуклеотидных подготовки:

(Примечание:. МО должны быть fluoresceinated (3'-карбоксифлуоресцеина изменение) или иным образом взимается)

1. Ресуспендируют морфолино олигонуклеотиды (МО) (Genetools, www.genetools.com ) в концентрации 2 мМ в нуклеазы свободного H ₂ 0.
2. Тепло аликвоту маточного раствора при температуре 65 ° С в течение 5 минут.
3. Развести до конечной концентрации 0,5 мМ в воде нуклеазы бесплатно.

* 0,1-1мм МО решения были протестированы. 0,5 мМ МО решения было достаточно для электропорации многих мезенхимальных клеток.

Микропипетки

1. Подготовка микропипетки из боросиликатного стекла капилляров (1 мм в ширину, 4 "длинный, WPI нет. TW100-F). Используйте иглу съемник для подготовки микропипетки с 8-12 мм длиной конуса и тонкой наконечником.
2. Давка наконечник ~ 2 ммот кончика использованием щипцов, создавая неровный разрыв.

Средства массовой информации

1. Инкубационный СМИ: Подготовьте свежий 3 / 4 Нормальная амфибия Media (ДН) от 1x акций. Добавить 0,025 мг / мл гентамицина.
2. Электропорация СМИ: как указано выше, с 0,1% Benzocaine (Sigma, 06950).

2. Электропорация

Микропипетки установки

1. Заполните микропипетки с ~ 1 мкл раствора инъекций.
2. Безопасные микропипетки в микроманипулятора и присоединить к microinjector (Picospritzer II).
3. Угол микропипетки на 50 ° от столешницы.
4. Установить давление впрыска при 20 PSI.
5. Калибровка микропипетки вводить 30 п на импульс.

Головастик подготовку

1. Обезболить этапе 28 Xenopus личинок в стадии инкубационного периода электропорации СМИ в течение 5 минут.
2. Передача под наркозом головастика в электропорации камере, наполненной электропорации СМИ. Позиция эмбрионав течение долгого хорошо так, чтобы голова упирается в Т-образном перекрестке с спинной стороной вниз и брюшной стороне подвергается. Голова должна быть слегка приподнята по сравнению с хвостом.
3. Использование щипцов, мягко безопасный головастика в хорошо с окружающими пластилина. (Примечание:.. Если головастика не обеспечен, он может дергаться и контактных электродов во время электропорации В этом случае отказаться от головастика, как ткани лица будут серьезно повреждены)

Электропорация

1. Вставьте наконечник микропипетки сразу кзади от цемента и железа в лице мезенхимы.
2. Inject 30 нл раствора в мезенхимы.
3. Уберите микропипетки.
4. Быстро выровнять электрода советы параллельно глава эмбриона (рис. 3).
5. Применить 8 50 мс, 20 мВ прямоугольных импульсов.
6. Уберите электродов.
7. Использование щипцов тщательно релиз головастика из скважины и передача на 3 / 4 ДН, 0,025 мг / мл гентамицина.
8. Головастики могут быть инкубировали в 3 / 4 ДН, 0,025 мг / мл overnIGHT, или дольше.
9. Экран эмбрионов для эффективного электропорации помощью флуоресцентной микроскопии после 24 часов.

3. Представитель Результаты:

Использование флуоресцентных молекул позволяет легко скрининг электропорации эмбрионов. На рисунке 4 показана типичная партия МО электропорации головастиков ~ 12, 48 и 96 часов после электропорации, инкубируют при 14,5 ° C. Использование флуоресцентной микроскопии, МО могут быть визуализированы сразу после электропорации и сохраняться в течение нескольких дней после электропорации. По нашему опыту, флуоресценции слабо заметен на стадии 46 (~ 5 дней позже). В хрящах, флуоресценция резко уменьшается после начала дифференциации (~ 42 м), однако, МО флуоресценции сохраняется сильнее, в другие типы клеток, такие как глоточной энтодермы. Флуоресцентная микроскопия показывает, что олигонуклеотиды были включены в несколько черепно-лицевых тканей, включая хрящ. Олигонуклеотидов флуоресценции сЧасто быть визуализированы в ткани по обе стороны головы. Это, вероятно, из-за быстрого распространения раствор для инъекций по всему свободные черепно-лицевой мезенхимы до электропорации.

Рисунок 1 Домашнее электродов. Г-образной вольфрамовой проволоки прикрепляется к 1 мл шприц использованием нетоксичных глины или замазки. (А) электрода конечной меры 5 мм. (B) Прикрепите пару электродов, например, что концы идут параллельно. Электроды крепятся к импульсным генератором с помощью кабелей постоянного тока.

Рисунок 2 Электропорация камеры. () 90 мм чашке выстроились с пластилином заполнена средствами массовой информации и Т-образной камеры резными щипцами № 5 часовщика. (B) длинной стороной меры 2 мм х 2 мм Х10 ммв то время как короткие меры 2 мм х 2 мм х 5 мм. Глава эмбриона лежит в Т-образном перекрестке, брюшной стороной вверх.

Рисунок 3 Схема иллюстрирующая электропорации процедуры. Св. 28 головастик находится в электропорации камеры, вентральной стороной вверх. Микропипетки вставляется в лице мезенхимы основной железы цемента. Inject. Микропипетки удаляется, и Г-образные электроды расположены вдоль фланговые голову. Применить восемь 50 мс, 20 мВ прямоугольных импульсов. Уберите электродов. Расти головастиков желаемого этапа. Визуализируйте МО или GFP выражения с помощью флуоресцентной микроскопии.

Рисунок 4 представителя головастиков 12 (А), 48 (Б) и 96 (С) часов после электропорации (стадии 30, 34 и 44 соответственно). ("-B") Флуоресцентные МО могут быть визуализированы в черепно-лицевой мезенхимы на оленях годов 30 и 34. Флуоресценции можно обнаружить в хрящах на стадии 44 (наконечник стрелы, С ^-С "). Кишка очень autofluorescent.

Обсуждение

В этом видео мы продемонстрировали возможности электропорации-опосредованной доставки генов в лице мезенхиме Xenopus головастиков. Используя этот подход, мы можем обойти на ранних стадиях развития последствия манипулирования функции гена позволяет нам ориентироваться на конкретные ткани в более поздние моменты времени. Наши исследования показывают, что гетерогенных популяций черепно-лицевой мезенхимальные клетки могут быть затронуты, что позволяет нам рассматривать линию электропорации клеток, а также автономные ячейки требования для белков, представляющих интерес. В сочетании с живой обработки изображений, мы можем использовать этот подход для изучения функций генов, с течением времени, в течение черепно-лицевой области развития. Этот новый метод подчеркивает уступчивость по Xenopus для изучения органогенеза. Мы ожидаем, что этот метод может быть широко адаптировано для изучения морфогенеза и дифференциации других тканей, а также.