Использование обратной генетики манипулировать АПЛ Ген Лихорадка Рифт-Валли Вирус MP-12 Штамм для повышения безопасности и эффективности вакцин

Резюме

Системы обратного генетике лихорадка Рифт-Валли Вирус MP-12 вакцинный штамм является полезным инструментом для создания дополнительных MP-12 мутантов с повышенной ослабления и иммуногенности. Мы опишем протокол для получения и характеристики АПЛ мутантных штаммов.

Аннотация

Вирус Рифт-Валли (RVFV), что вызывает геморрагическую лихорадку, неврологические расстройства или слепоты у людей, и высокое число абортов и пороков развития плода у жвачных ^1, была классифицирована как HHS / USDA перекрытия выбрать агента и группы риска 3 возбудителя. Он принадлежит к роду Phlebovirus в семье буньявирусов и является одним из наиболее опасных членов этой семьи. Несколько систем обратного генетике RVFV MP-12 вакцинного штамма ^2,3, а также дикого типа RVFV штаммы ^4-6, в том числе и ZH548 ZH501, были разработаны с 2006 года. MP-12 штамма (который группа риска 2 возбудителя и без выбора агента) сильно ослаблена несколькими мутациями в М-и L-сегментов, но все еще ​​несет вирулентных S-сегмента РНК ^3, который кодирует функциональный вирулентности фактор, НЗ. RMP12-C13type (C13type) проведение 69% в рамке удаление АПЛ ORF не хватает все известные функции АПЛ, в то время как она воспроизводит efficэтом удобно так же как и МП-12 в клетках не хватает VeroE6 типа я ИФН. АПЛ вызывает запорной принимающих транскрипции в том числе интерферона (ИФН)-бета-мРНК ^7,8 и способствует деградации двухцепочечной РНК-зависимой протеинкиназы (PKR) в пост-трансляционной уровне. ^9,10 ИФН-бета транскрипционно upregulated интерфероном регуляторного фактора 3 (IRF-3), NF-Кб и активатором белка-1 (AP-1), а также связывание ИФН-бета IFN-alpha/beta рецепторов (IFNAR) стимулирует транскрипцию интерферона-альфа генов или других интерферонов стимулировали генов (ISGs) ^11, который индуцирует хост противовирусных мероприятий, в то время как хозяин транскрипции в том числе подавление ИФН-бета гена АПЛ предотвращает гена upregulations тех ISGs в ответ на вирусную репликацию, хотя IRF-3, NF-Кб и активатор белка-1 (AP-1) может быть активирована RVFV7. . Таким образом, НЗ является отличная мишень для дальнейшего ослабления MP-12, а также расширить хост врожденного иммунного ответа путем отмены ИФН-бета подавление функции. ЗдесьМы опишем протокол для создания рекомбинантных MP-12 кодировке мутировал АПЛ, и представляют собой пример метода скрининга для выявления АПЛ мутанты отсутствуют функции для подавления ИФН-бета-мРНК, синтез. В дополнение к его существенную роль в врожденного иммунитета, типа я ИФН важно для созревания дендритных клеток и индукции адаптивного иммунного ответа ^12-14. Таким образом, мутанты, вызывающие АПЛ типа я ИФН еще более ослабленной, но в то же время являются более эффективными в стимулировании иммунной ответов, чем дикого типа МП-12, что делает их идеальными кандидатами для вакцинации подходов.

протокол

1. Восстановление рекомбинантных MP-12 кодировке АПЛ мутации (ы) из плазмиды ДНК ²

1. Распространение ребенка почек хомяка (ВНК) / T7-9 клетки ^15, которая стабильно выразить Т7 РНК-полимеразы, в 6-см блюда в минимальных базовых средних (MEM)-альфа (Invitrogen, Cat # 32561037), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS ), пенициллин-стрептомицина (пенициллин: 100 Ед / мл, стрептомицин: 100 мкг / мл) (Invitrogen, Cat # 15140122), и 600 мкг / мл гигромицину B (Cellgro, Кат № 30-240-CR).
   * Эффективность вирусных восстановления выше в 6-см блюд, чем в 35-мм блюд. BHK/T7-9 клеток с низким уровнем прохождения обеспечивают более высокие темпы восстановления. Кроме того, другие клеточные линии ВНК, что стабильно выразить Т7 РНК-полимеразы могут быть использованы ^4,5,16,17.
2. Когда клетки достигли 70-80% слияния, замените супернатанта культуры со свежими MEM-альфа, содержащей 10% FBS и пенициллин-стрептомицина (не содержащие гигромицину B).
   
   * Клетки должны быть transfecteг в течение 1 часа после замены среды, чтобы избежать потери T7 выражение РНК-полимеразы.
3. Для восстановления RVFV, набор плазмид кодирования вирусной геномной РНК для полнометражного вирусной РНК выражение, а второй набор кодирования вирусный ген, открытые рамки считывания для вирусных экспрессии белка (рис. 1 и 2) не требуется. Приготовить смесь из следующих plasmids2 (рис. 2) в 1,5 мл трубки:
   1. pProT7-S (+) с мутацией (ы) в гене НЗ (2 мг): Эта плазмида кодирует антивирусные смысла (положительно смысле) во всю длину RVFV MP-12 S-сегменте окружении промоутер T7 и Вирус гепатита дельта (HDV) рибозим последовательности.
   2. pProT7-М (+) (2 мг): Эта плазмида кодирует антивирусные смысла (положительно смысле) во всю длину RVFV MP-12 М-сегменте окружении промоутер T7 и последовательности HDV рибозима.
   3. pProT7-L (+) (2 мг): Эта плазмида кодирует антивирусные смысла (положительно смысле) во всю длину RVFV MP-12 L-сегмент FLAnked от промоутера T7 и последовательности HDV рибозима.
   4. pT7-IRES-VN (2 мг): Эта плазмида кодирует RVFV MP-12 N открытые рамки считывания (ORF) вниз по течению от промоутера T7 и энцефаломиокардита вируса (EMCV) внутренний сайт рибосомы въезд (IRES).
   5. pT7-IRES-VL (1 мг): Эта плазмида кодирует RVFV MP-12 L ORF ниже по течению от промоутера T7 и EMCV IRES.
   6. pCAGGS-VG (1 мг): Эта плазмида кодирует RVFV MP-12 М ORF ниже по течению от куриного бета-актина промоутера.
      * Добавление pT7-IRES-В.Н., pT7-IRES-VL и pCAGGS-VG не является необходимым для восстановления MP-12, но это повышает эффективность спасательных ^2. Авторы опытных бедных выражения Gn / Gc с помощью pT7-IRES плазмиды, вероятно, из-за отсутствия вытекающих сканирование AUGs рибосомами. Таким образом, мы построили pCAGGS-VG для крышки зависит от Gn / Gc выражения.
      
      
4. Добавить 30 мл Транзит-LT1 (Mirus, Cat # MIR2300) до 385 мл Opti-MEM (Invitrogeп, Cat # 31985070) в 1,5 мл трубки, и вихрь кратко.
5. Через 5 мин инкубации при комнатной температуре, медленно добавить Opti-MEM содержащих липосомы с плазмиды смеси от 1,3 до шага, аккуратно перемешать с помощью пипетки и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре.
6. Добавить смесь липосом и плазмиды в культуральной среды BHK/T7-9 клетки шагом 1,2 по капле (рис. 3).
7. Инкубируйте трансфицированных клеток при 37 ° C в инкубаторе с 5% CO ₂ в течение 24 ч, и заменить супернатанта культуры со свежими MEM-альфа, содержащей 10% FBS и пенициллин-стрептомицина (не содержащие гигромицину B).
8. Инкубируйте клетки при 37 ° C в инкубаторе с 5% CO ₂ в течение 4 дополнительных дней (инкубировать 5 дней всего), и собирают супернатанты культуры в 15 мл трубки.
   
   * Цитопатический эффект (ЦПЭ) здесь наблюдается не обязательно отражает результат успешной вирусной восстановления, потому что трансфекциивызывает гибель клеток, которая появляется похож на CPE вызванных вирусной репликации РНК или вирусной синтеза белка.
9. Центрифуга супернатантов при 2200 мкг при 4 ° С в течение 5 мин.
   
   * Цель этого шага заключается в гранулах до распада клеток от вирусных акций. Аэрозоль-плотные центрифуги ведро рекомендуется для повышения безопасности.
10. Передача супернатанты в завинчивающейся крышкой 5 cryotubes мл, и хранить проход 0 (Р0) вирус фондовом при -80 ° C для дальнейшего использования.

2. Усиление P0 вирус

1. P0 образцы часто содержат недостаточное вирусного титра для последующих экспериментов ^2. Усиление шаг в VeroE6 клеток, что клон африканских зеленых мартышек почек (Vero) клеток не хватает IFN-alpha/beta генов ^18,19, увеличивает вирусную титра до максимального уровня. Кроме того, другим клеткам не хватает типа я ИФН ответов, таких как клетки Hec1B ²⁰ или MEF клетки IFNAR1-нокаутных мышей ²¹ mighт быть использованы для этого шага. Распространение VeroE6 клеток в 10-см блюд в модифицированной минимальный Дульбеко необходимой среде (DMEM) (Invitrogen, Cat # 11965092), содержащей 10% FBS, пенициллин-стрептомицина (пенициллин: 100 Ед / мл, стрептомицин: 100 мг / мл), и инкубировать при 37 ° C в инкубаторе с 5% CO _2, пока они не достигнут 80% слияния.
   * Рекомбинантный MP-12 штаммов кодирования мутант НЗ часто не в состоянии повторить эффективно типа я ИФН-компетентных клеток.
2. Смешайте 300 мл P0 образцов с 2,7 мл DMEM с 10% FBS и пенициллин-стрептомицина. Удалить из культуральной среде VeroE6 клетки, начиная с шага 2.1 и заменить разбавленным P0 образца. Инкубировать при 37 ° С в течение 1 ч в инкубаторе с 5% CO _2.
3. Удалить инокулята и добавить 10 мл DMEM с 10% FBS и пенициллин-стрептомицина к каждому блюду.
4. Инкубировать при 37 ° С в течение от 3 до 4 дней, пока CPE из VeroE6 клетки становится очевидной.
   * Нарушение монослоя происходит во время МП-12 инфекции, whilэлектронной рекомбинантный MP-12 не хватает НЗ, такие как rMP12-C13type (C13type) (рис. 4), не нарушает монослоя, но число погибших плавающие клетки появляются от 2 до 3 дней после заражения.
5. Урожай супернатант от 3 до 4 точек на дюйм, как описано в разделах 1.9) и 1,10), а также назначить образцов E6P1.

3. Титрование рекомбинантный MP-12 бляшкой анализа

1. Распространение VeroE6 клеток в 6-луночных планшетах.
   * Повторяющиеся анализ по образцу более надежна, чем одного анализа.
2. Когда VeroE6 клетки выросли на 80% слияния, готовят 10-кратным серийные разведения образцов вирусов в DMEM с 10% FBS и пенициллин-стрептомицина до 10-6 следующим образом:
   
   • 10 мкл образца E6P1 + 990 мл DMEM с 10% FBS и пенициллин-стрептомицина (10 ^-2 разбавления)
   • 100 мкл 10 ^-2 образца + 900 мл DMEM с 10% FBS и пенициллин-стрептомицина (10 ^-3 разбавления)
   • 100мкл 10 ^-3 образца + 900 мл DMEM с 10% FBS и пенициллин-стрептомицина (10 ^-4 разбавления)
   • 100 мкл образца 10 ^-4 + 900 мл DMEM с 10% FBS и пенициллин-стрептомицина (10-5 разведения)
3. Аспирируйте среды от 6-луночный планшет с шагом 3,1 и добавьте 400 мкл каждого разведения (с шагом 3.2) в скважинах (рис. 3).
4. Инкубировать при 37 ° С в течение 1 ч в инкубаторе с 5% CO _2.
5. Во время инкубации, подготовить два 15 мл трубы для агар-наложения следующим образом:
   Труба (имейте в 42 ° С водяной бане): 7 мл 1,2% благородных агар (VWR, Cat # 101170-362) в воде
   Труба В (имейте в 37 ° С водяной бане): 7 мл модифицированного Eagle Средняя (MEM 2x) (Invitrogen, Cat # 11935046), содержащей 10% FBS, пенициллин-стрептомицина (пенициллин: 100 Ед / мл, стрептомицин: 100 мкг / мл), и 10% фосфатов Tryptose бульон (MP Biomedicals, Cat # 1682149).
6. Через 1 ч инкубации, удалить вирусныеинокулята, и сразу же добавьте 2 мл на лунку смесь 1:1 трубки и трубки B (с шагом 3,5).
   * Следите за тем, чтобы добавить наложение сразу же, как высыхание скважин причины смерти неинфицированных клеток.
7. Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение 3 дней в инкубаторе с 5% CO _2.
8. Подготовка трубки и трубки B снова, как описано в пункте 3.5. Подготовка и 500 мкл 0,33% нейтральный раствор красного (Sigma Aldrich, Cat # N2889-100мл) на пластину, которая также хранится при температуре 37 ° С водяной бане.
9. Смешайте трубки, трубки B и 500 мл (конечная конц. 0,011%) нейтральных красный раствор и добавьте 2 мл смеси в каждую лунку.
   * Количество нейтрального красного решения, которые будут добавлены зависит от многих нейтральный красный раствор, и начальная оптимизация не требуется. Долгосрочное хранение 0,33% нейтрального красного решение вызывает осаждение. В таких случаях, осадок может быть полностью распущен инкубации при 55 ° С в течение 10 мин, а затем путем энергичного встряхивания. Использование осажденный нейтральной тред решение приводит к слабым окрашивания клеток, в то время снова растворяли нейтральный красный раствор пятна клетки хорошо.
10. Инкубируйте планшет в течение 16 часов (или на ночь) при 37 ° C в инкубаторе с 5% CO _2.
11. Подсчитайте количество бляшек в колодец, который содержит от 10 до 100 бляшек на лунку. Подсчитать количество бляшкообразующих ед / мл. Например, если мы наблюдаем 28 бляшек в скважинах засевают 10 ^-5 разведения, 28 (# бляшек) х (1 ml/0.4 мл) х 10 ⁵ (разбавления) = 7,0 • 10 ⁶ бляшкообразующих единиц (БОЕ) / мл (рис. 5).

4. Скрининг АПЛ мутантов не хватает типа я ИФН подавления функции

1. Распространение C57/WT MEF клеток (InvivoGen, Cat # MEF-c57wt), которые кодируют эмбриональные выделяется щелочной фосфатазы (СЕАП) гена индуцибельной от NF-Кб и ФИА-3 / 7 (рис. 6), в 12-луночных планшетах. Клетки сохраняются в DMEM с 10% FBS, пенициллин-стрептомицина (PeniciОИСДП: 100 Ед / мл, стрептомицин: 100 мкг / мл), Blasticidin S (3 мг / мл) и Zeocin (100 мкг / мл).
2. Когда клетки становятся к югу от сливной (80%), клетки макет-инфицированных или инфицированных MP-12 или рекомбинантного MP-12 кодировке АПЛ мутации в множественности заражения (МВД) в размере 3 или 0.1 (см. разделы 2 и 3, количество каждый посевной должна быть 300 мкл). На 1-инфекции сообщению ч, удалите инокулята, и добавьте 1 мл на лунку DMEM с 10% FBS, пенициллин-стрептомицина (пенициллин: 100 Ед / мл, стрептомицин: 100 мкг / мл) (Blasticidin и Zeocin не добавляются в этот времени).
3. В 14 ч после инфекции, собирают супернатанты культуры. Добавить 200 мкл коли-синий (InvivoGen, Cat # пред-QB1) и 50 мкл каждого образца (в трех экземплярах) до лунки 96-луночного планшета. Печать и инкубировать пластины при температуре 37 ° С в течение 1 ч.
   * Оба МП-12 и рекомбинантных MP-12 не хватает АПЛ ясно вызвать хост поступательного подавления в IFN-alpha/beta компетентных клеток в том числе 293 клеток, MRC-5 клеток и мыши EMBRйони фибробласты (MEF) клеток после 14 часов после инфицирования при высоких МВД. С другой стороны, ИФН-бета-мРНК или иРНК ISG56 накапливается в изобилии от 7 до 8 часов после инфекции в тип-I IFN компетентных клеток. Таким образом, мы выбрали 14 часов после инфицирования собирать супернатанты видеть накопления SEAP индуцированных врожденных иммунных реакций.
4. Прочитано значения ОП при 650 нм, используя ридер (рис. 7).
   * Результаты согласуются с данными, полученными Северной пятно использованием зонда РНК, характерные для мыши ISG56 мРНК, которая проявляется регуляции ISG56 мРНК в отсутствие НЗ выражении (рис. 8).
   * Следует отметить, что деятельность СЕАП определяется обилие белков, которые могут пострадать от хоста деятельности перевода. Относительный уровень SEAP не может быть высокой по сравнению с возросшим уровнем мРНК, потому SEAP не могут быть синтезированы еще в присутствии SEAP мРНК, если сотовая перевод supprЭссед. Северный пятно является более простой анализ и более точно оценить количество мРНК индуцированной из-за отсутствия АПЛ функции в инфицированных клетках, чем анализ репортер СЕАП. Тем не менее, система SEAP репортер происходит быстрее, чем Северное пятно и, следовательно, полезны для быстрого скрининга АПЛ мутантов потенциально отсутствует хозяин транскрипции подавление функции.
   
   

5. Представитель Результаты:

Системы обратного генетики последовательно порожденных жизнеспособных рекомбинантных MP-12 вирусов с титром выше, чем 1 х 10 ⁶ БОЕ / мл. C13type вирус не хватает АПЛ функции образуются большие бляшки мутной, в то время как MP-12 сформирована ясно бляшки различных размеров ² (рис. 5). Мок-инфицированных C57/WT MEF клеток или инфицированных MP-12 не повысит уровень СЕАП в супернатант культуры по сравнению с макетом инфицированных клетках, в то время как культура супернатанта C57/WT клетки MEF инфицированных C13type содержащихся увеличилсяУровень SEAP на 14 часа после заражения (ИНН) (рис. 7). Эти результаты согласуются с результатами, полученными при использовании Северного пятно зонда РНК, характерные для мыши ISG56 мРНК (рис. 8).

Рисунок 1. Геном структуры RVFV
RVFV имеет трехсторонний отрицательного смысла или ambisense РНК генома названный S-, M-и L-сегменте. S-сегмент кодирует N и НЗ генов в ambisense образом. N мРНК синтезируется из-вирусное смысле (отрицательного смысла) S-сегмента, в то время как АПЛ мРНК синтезируется из антивирусных смысла (положительного смысла) S-сегменте. М-сегмент кодирует одну мРНК M и синтезирует the78kD, Н • м, Gn или Gc белков вытекающей сканирования нескольких AUGs на 5'region мРНК M, а затем их совместного поступательного расщепления ^22,23. L-сегмент кодирует белок L. Оба N и L белки необходимы для вирусной транскрипции и репликации, а Gn и Gc являются вирусные белки конверте. НЗ и Н • м белки неструктурных белков, которые не включены в вирусные частицы.

Рисунок 2.. Дизайн плазмидной ДНК для восстановления рекомбинантных RVFV MP-12 штамма
КДНК, кодирующей полнометражный анти-вирусных смысла, S-, M-или L-сегменте cloneddownstream промоутера T7 и вверх по течению от вируса гепатита дельта (HDV) рибозим последовательности, обозначенные как pProT7-S (+), pProT7-М (+), или pProT7-L (+), соответственно ^2. Т7 РНК-полимеразы выражается в BHK/T7-9 клетки транскрибирует кодирование РНК полнометражный S-, M-или L-сегмент с точным конце генома 3 '. Открытые рамки считывания (ORF) в N или L белки клонированных под энцефаломиокардита вируса (EMCV) внутренний сайт рибосомы въезд (IRES), которые обозначены как pT7-IRES-VN или pT7-IRES-VL, соответственно, позволяют без колпачков T7 РНК стенограммы, чтобы быть признанными рибосомы в кепке-независимыхвмятина образом. М ORF клонируется под куриный б-актина промоутер pCAGGS плазмиды ^24, которая обозначена как pCAGGS-VG, чтобы синтез 78kD, Н • м, Gn и Gc белки, которые образуются из разных AUGs по вытекающей сканирования ^23. Оба N и L белки, необходимые для инициирования транскрипции или репликации РНК, в то время pT7-IRES-VN и pT7-IRES-ВЛ не являются необходимыми для восстановления рекомбинантных MP-12 ^2, вероятно, связано с предположительным вытекающей выражение Pol- II-приводом ограничено РНК-транскрипты кодирования N-ORF и L-ORF из pProT7-S (+) и pProT7-L (+), соответственно.

Рисунок 3. Восстановление RVFV MP-12 из плазмидной ДНК
Трансфекция BHK/T7-9 клеток с pProT7-S (+), pProT7-М (+), pProT7-L (+), pT7-IRES-В.Н., pT7-IRES-VL и pCAGGS-VG плазмиды (рис.1 ) создает инфекционных рекомбинантный RVFV MP-12 напряжение в супернатант культурыs. Супернатант в 5 трансфекции сообщение день собираются, и пассировать на свежий Vero E6 клеток для вирусного усиления. Как правило, более 1 х 10 ⁶ БОЕ / мл вирус может быть восстановлен на 3 до 4 дней после инфекции. Усиливается вируса (вирус E6P1) титруют с помощью доски анализа с Vero E6 клеток и используются для анализа фенотипа и иммуногенность исследований.

Рисунок 4. S-сегмента МП-12 и rMP12-C13type
Сравнение МП-12 и rMP12-C13type (C13type) S-сегментов. По сравнению с АПЛ MP-12 штамм, НЗ ORF из C13type урезается на 69%, и такая же, естественно изолированных клон 13 штамма ^2,25.

Рисунок 5. Налет тест для MP-12 (функциональные НЗ) и C13type (нефункциональные НЗ)
Монослой Веро E6 элементов в 6-луночный планшет используется для доски анализа. Через 3 дня инкубации с 0,6% агара наложения, второй наложения агара, содержащего нейтральный красный раствор добавляют. Затем, бляшки считаются по 4-й день после заражения. MP-12 формы ясно бляшки различных размеров, в то время C13type образует крупные бляшки мутной (или очагов). А с 10 до 100 бляшки должны использоваться для подсчета голосов.

Рисунок 6. Активация путь выделяется щелочной фосфатазы (СЕАП), репортер ген в клетки C57/WT MEF
Интерферон-бета-промоутер включает в себя обязательную последовательность АР-1, NF-Кб и ФИА-3. RVFV репликация активирует AP-1, NF-Кб и ФИА-3 ^7,11. Тем не менее, АПЛ ингибировать высвобождение репрессор комплекса с ИФН-бета-промоутер даже после связывания этих транскрипционных факторов, тем самым подавляя синтез ИФН-бета-мРНК ^26. Кроме того, АПЛ секвестры TFIIH P44 и subunits8РБП способствует деградации TFIIH P62 подразделения ^27, таким образом вызывая общее подавление транскрипции хост в том числе интерферона-альфа-гена и гена под ISRE промоутера. C13type или других АПЛ мутантов не хватает ИФН-бета подавление функции вызывают ИФН-бета-синтез, который, в свою очередь, активирует ИФН-альфа-промотора и интерферон-чувствительный элемент ответа (ISRE) промоутера. IRF-7 является то транскрипционно upregulated по IFN-alpha/beta стимулирование и дальнейшее upregulated на ИФН-альфа в поддержку IRF-3 ^28,29. В данном анализе C57/WT MEF клетки кодируют выделяется щелочной фосфатазы (СЕАП) на выходе из искусственного обязательной последовательности NF-Кб, IRF-3 и IRF-7. Таким образом, НЗ мутантов не хватает ИФН-бета подавление функции upregulate SEAP которого секреции затем измеряется.

Рисунок 7. Индукция СЕАП по C13type
C57/WT MEF клеток (InvivoGen) были макет-Инфицированным или инфицированных MP-12 или rMP12-C13type (C13type) при МВД 3 (левая панель) или 0,01 (правая панель). Культура супернатанты (50 мкл) в 14 HPI смешивали с 200 мкл коли-синий (InvivoGen) субстрата в 96 ячейках и значения ОП при 650 нм измеряли через 1 ч инкубации при температуре 37 ° С ридер. Относительное увеличение SEAP издеваться над-инфицированные клетки показано на рисунке. Данные представляют собой среднее значение + / - стандартное отклонение из трех независимых экспериментов. Супернатант культуры от C13type-инфицированные клетки показывает увеличение SEAP, предполагая отсутствие принимающих подавления транскрипции НЗ.

Рисунок 8. Северной промокните DIG-меченой РНК зонд
Дикого типа мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) клетки макет-инфицированных или инфицированных MP-12 или rMP12-C13type (C13type) при МВД 3. Тотальная РНК была собрана в 7 HPI с помощью Trizol (Invitrogen), и Северной бМного было выполнено с помощью дигоксигенин-меченой РНК зонд специфичные для мыши эндогенных ISG56 мРНК или MP-12 N мРНК / анти-вирусной смысле S-сегменте ^2,30. Для изготовления зондов для мыши эндогенных ISG56 мРНК или иРНК RVFV N / анти-вирусной смысле S-сегмента, ПЦР-фрагментов усиливается грунтовки набор KpnmISG56F (GGG TGG TAC CGC TCC ACT TTC AGA GCC TTC GCA AAG CAG) и HindmISG56 (TAC AAA GCT ТАТ GGG AGA ГАА ТГК TGA TGA TGG ОСО GG) для ISG56 мРНК или KpnNF (АГТ TGG TAC CAT GGA CAA CTA TCA AGA GCT ТГК G) и HindNR (GGG CAA GCT ТТТ AGG CTG CTG TGT AAG TCT) для RVFV N мРНК / анти-вирусной смысле S-сегменте переваривали Kpn я и Hind III, и лигировали в pSPT18 плазмиды (Roche. Затем РНК проб, соединенных с дигоксигенин были синтезированы с помощью РНК-DIG Маркировка Kit (SP6/T7) (Roche, Cat # 1 175 025). уровне 28S рРНК каждого образца также показано, как загрузка контроля. дикого типа MEF клетки, инфицированные C13type индуцированных ISG56 мРНК синтез, а те, инфицированных МП-12 Не побудить его, предполагая отсутствие принимающих транскрипции подавления в C13type-инфицированных клеток. Данные согласуются с результатами, полученными при анализе SEAP на рисунке 6.

Обсуждение

Обратной генетики системы RVFV были разработаны несколько групп, используя T7 промоутер ^2,4,5 или мыши ³ или ⁴ человека поли-я промоутер. В этой рукописи, мы опишем протокол для получения рекомбинантных RVFV MP-12 штаммов с помощью BHK/T7-9 клетки ^15, что стабильно выразить Т7 РН...

Материалы

Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии (необязательно)
Минимально необходимые Средняя (MEM)-альфа	Invitrogen	32561037
Изменение минимального Дульбеко необходимой среде	Invitrogen	11965092
Измененный Eagle Средняя (MEM 2x)	Invitrogen	11935046
Пенициллин-Стрептомицин	Invitrogen	15140122
Гигромицину B	Cellgro	30-240-CR
Tryptose фосфатного бульона	MP Biomedicals	1682149
Нобль-агар	VWR	101170-362
Транзит-LT1	Mirus	MIR2300
Opti-MEM	Invitrogen	31985070
Аэрозоль плотной крышкой	Эппендорф	C-2223-25
0,33% раствор нейтрального красного	Sigma Aldrich	N2889-100мл
C57/WT MEF клетки	InvivoGen	MEF-c57wt
Blasticidin S	InvivoGen	Ant-BL-1
Zeocin	InvivoGen	Муравей-Zn-1
Количественно-Blue	InvivoGen	пред-QB1
BHK/T7-9 клетки 15	Гифу университета, Япония
Vero E6 клетки	АТСС	CRL-1586