Измерение γHV68 инфекции у мышей

Резюме

γ-Herpesviruses (γ-HVS) устанавливает пожизненное настойчивость в их хозяина. Заражение мышей с γ-HV68 обеспечивает генетически послушный В естественных условиях Модели для характеристики жизненного цикла / патогенезе γHVs. Этот протокол описывает обнаружения и количественного определения γHV68 инфекции при острых и латентных стадиях после заражения бляшкообразующих, инфекционный центр, и КПЦР анализов.

Аннотация

γ-Herpesviruses (γ-HVS) отличаются способностью устанавливать скрытые инфекции лимфоидных клеток ^1. Узком диапазоне множество человеческих γ-HVS, таких как ВЭБ и KSHV, серьезно препятствует детальные исследования патогенных. Мышей γ-герпесвирусов 68 (γHV68) акций обширные генетические и биологические сходства с человеческим γ-HVS и является естественным возбудителем мюрид грызунов ^2. Таким образом, оценка γHV68 заражение мышей инбредных линий на разных стадиях вирусной инфекции служит важной моделью для понимания вирусной жизненного цикла и патогенез при γ-HVS инфекции.

После прививки интраназально, γHV68 инфекция приводит к острой виремии в легких, который позже решил в латентной инфекции спленоцитов и других клеток, что может быть возобновлен в течение всего срока хост ^3,4. В этом протоколе мы опишем, как использовать доску анализа для оценкис инфекционным титром вируса в легких гомогенатах на Веро монослоев ячейки на ранней стадии (5 - 7 дней) после интраназального заражения (точек на дюйм). Хотя острой инфекции в значительной степени очистили 2 - 3 недели postinfection, латентной инфекции из γHV68 установлено около 14 точек на дюйм и поддерживаться в дальнейшем в селезенке мышей. Скрытая инфекция обычно поражает очень небольшой популяции клеток в инфицированных тканях, при этом вирус остается бездействующим и отключает большую часть своей экспрессии генов. Латентно-инфицированных спленоцитов спонтанно активировать вирус на культивирующий в искусственной среде в культуре ткани, которая может быть кратко изложил на инфекционный центр (ИЦ) анализа для определения вирусной нагрузки скрытой. Для дальнейшей оценки количества вирусных копий генома в острой и / или латентно инфицированных тканей, количественный ПЦР в реальном времени (КПЦР) используется для его максимальной чувствительности и точности. Комбинированный анализ результатов КПЦР и налета анализа и / или IC анализ покажет пространственно-временные профили вирусногорепликации и инфекционности в естественных условиях.

протокол

Следующий протокол будет описывать изучение вируса титры и вирусной нагрузки генома в литический и латентной инфекции цикл γHV68 у мышей, которые теоретически могут быть использованы для оценки заражения другими вирусами с похожими образ жизни, что и γHV68.

1. Усиление γHV68

1. Оттепель замороженных флакон γHV68 в 37 ° С водяной бане.
2. Добавить к вирусным inoculums NIH3T12 или культуры клеток 3T3 (~ 50% слияния) в 10 см блюда и культуры инфицированных клеток при 37 ° С в 5% СО _2.
3. Изучение культуры микроскопии для цитопатический эффект (ЦПЭ) и сбор средств массовой информации в период, когда более 80% клеток показывают, CPE, 4 ~ 5 дней после заражения. Для максимального выхода вируса, инфицированные культуры клеток можно заморозить-и-талого дважды, чтобы освободить всех клеточно-ассоциированных γHV68.
4. Центрифуга собранных средств массовой информации при 1000 оборотов в минуту в течение 5 мин при комнатной температуре (RT), чтобы удалить ячейку мусора.
5. Тщательно передачи супернатантах к новой трубы (высокоскоростной центрифуге трубки), не касаясь ячейки мусора на дне.
6. Высокоскоростные центрифуги при 12000 оборотов в минуту (для Sorvall SA-600) при температуре 4 ° С в течение не менее 1,5 часов, чтобы сосредоточиться вирусных частиц.
7. Отменить супернатанты в 10γ отбеливающим раствором и тщательно повторно приостанавливать гранул (вирус и остаточного мусора ячейки) с 1 мл бессывороточной DMEM. Передача ресуспендировали гранулы в 1,5 мл микро-центрифуге трубки и хорошо перемешать на вортексе.
8. Центрифуга в течение 2 мин при максимальной скорости для удаления остатков мусора клеток и передачи супернатант (вирус акций) в новую пробирку. Это последняя вирусная акция для инфекции. Титр вируса акции определяется доска анализа (см. ниже).

2. Интраназально Заражение мышей с γHV68

1. Infect мышей при ~ 6-недельного возраста с 1000 ~ 5000 бляшкообразующих единиц (БОЕ) в γHV68 на мышах.
2. Анестезироватьмышей на инъекции кетамина / ксилазина (60 мкл / мышь из смеси 80 мг / мл кетамина и 12 мг / мл ксилазина) в брюшную полость. Монитор анестезии, зажимая мышей ног. Обычно это занимает ~ 5-10 мин. Если мышь не в полной мере под наркозом, то они будут чихать вируса.
3. При наведении курсора мыши полностью под наркозом, использование пипетки привить ~ 30 мкл PBS содержащие γHV68 (15 мкл в каждую ноздрю) мышам капельный медленно, но неуклонно. Убедитесь, что мышь действительно вдыхание капель, не пытаясь форме пузырьков.
4. Разрешить мыши для восстановления в течение 10-15 мин и контролировать благополучие мышей (например, сознание, дыхание и т.д.) перед их возвращением в клетку. Животные проверяются ежедневно в течение болезни и адекватности пищи, воды и постельные принадлежности условиях. Если клинические признаки болезни, боль или страдание развиваться, рутинной диагностики для определения этиологии будет проводиться. Животные, которые теряют более 20% своего веса будет записан для максимального снижения весаи эвтаназии. Окончательное решение о проведении эвтаназии по усмотрению клинического ветеринара и производится после консультации с главным исследователем.

3. Зубной налет Пробирной для определения титра вируса в зараженных Остро Легкие

1. Титр вируса инфекционной определяются образование бляшек на монослоев клеток Веро.
2. Веро клетки высевают на 2.5x10 ^{4 клеток} / лунку в 12 хорошо пластин день до доски анализа. Камеры должны быть равномерно распределены и плотность клеток должна достигать 30 - 40% в день налета анализа.
3. Подготовка 0,5% (вес / объем) метилцеллюлозы (МЦ) наложение среде (табл. 1).
4. Жертва γHV68-инфицированных мышей через 5-7 дней после интраназального инфекции для определения острой фазы титр вируса в легких. Для euthanization Кетамин HCl (80-100 мг / кг подкожно, IM, IP) будут администрируемых IM последующей внутривенной передозировки Na пентобарбитала (30-50 мг / кг, IP). Этот метод утвержден тон Американской Ветеринарной Медицинской Ассоциации.
5. Урожай легких и полоскать два раза с 1 х PBS для удаления клеток крови. Сбор одной стороны легких в 1 мл ледяной полной среде DMEM и держать на льду. Быстрое замораживание другой стороны легких и хранить при температуре -80 ° С для изучения вирусной нагрузки ДНК в легкие КПЦР (см. ниже).
6. Использование ткани гомогенизатор для гомогенизации ткани легких при максимальной скорости в течение 1 сек, замораживания-оттаивания и в три раза. Вымойте гомогенизатор с 70% этанола на каждом шагу при смене образца.
7. Центрифуга гомогенизированных тканей при 3000 оборотов в минуту в течение 10 мин при 4 ° C. Сбор супернатант и перехода на новые трубы для доски анализа.
8. Подготовка серийных разведений (обычно от 10 ° до 10 ^-8) легких гомогената образцов в 1,5 мл микро-пробирок с простым DMEM от вихря. Заполнять соответствующее количество труб с 540 мкл DMEM и разбавленных 60 мкл гомогената в первые трубки. Передача 60 мкл из первой трубки яНе следующий, и так далее.
9. Аспирируйте средств массовой информации из подготовленных Веро монослоев в 12-луночных планшетах и нагрузка 200 мкл / лунку последовательно разбавлены гомогената, содержащие инфекционные вирусы в обратном порядке (от 10 ^-8 до 10 °). Использование двух скважин для каждого титрования (в двух экземплярах).
10. Инкубируйте Веро клетки с вирусом inoculums 1 час при температуре 37 ° C. Аккуратно водоворот пластин каждые 15 минут, чтобы равномерно распределить вирус на монослой.
11. Удалить inoculums и заменить его на 2 мл / лунку наложения среде (табл. 1). Инкубируйте пластин в течение одной недели при температуре 37 ° C.
12. Удаление наложения среды (не нужно быть полным) и заменить исправить / пятно среде доска анализа (табл. 1) и инкубировать в течение по крайней мере на 1 час при комнатной температуре.
13. Когда пластины сушат, подсчитать количество хорошо изолированных бляшек на каждого разведения. Чтобы свести к минимуму ошибки, только скважин, содержащих от 10 до 100 бляшек, подсчитываются.
14. Рассчитать титр вируса использованием ФоллоКрыло формуле: титр (БОЕ / мл) = [(число бляшек / а) / (Объем inoculums / а)] х коэффициент разведения.

4. Инфекционные Пробирной центр для определения вирусной нагрузки в латентно инфицированных Спленоциты

1. Вирусная нагрузка скрытой определяется инфекционный центр (ИЦ) анализ на монослой клеток Веро. Накануне IC анализа, семена клеток Веро в 6-луночных планшетах (1 -. 2,5 • 10 ^{5 клеток} / лунку Мы обычно используем 11 скважин в селезенке образца, 10 скважин будут использованы для серийно разведенной суспензии спленоцитов и одной скважины для тестирования спонтанной реактивации вируса после циклов замораживания-оттаивания.
2. Жертва инфицированных мышей после задержки устанавливается (12 - 14 дней после заражения). Урожай селезенки мыши и бассейном их в 1 мл охлажденной DMEM.
3. Механическая диссоциация мыши селезенки. Передача свежевыделенных селезенки мышей в 10 см тарелку и добавить 10 мл желаемого среде, такой как DMEM с 2% ЭТС. Влажные два матовое стекло класса microscОПЕ слайды с ледяной среде. Место селезенки на стороне матового одного слайда и ник капсула с краю замороженный конец другой слайд. Механически отделить селезенку между двумя слайдами, пока все красные сгустки измельчаются (также удалить жировые частицы, если имеется).
4. Промыть слайды с DMEM восстановить оставшиеся клетки с обеих слайдов.
5. Передача всей подвески ткани мягко через ячейки сетчатого фильтра (40 мкм нейлоновая сетка) в 50 мл коническую завинчивающейся крышкой трубки. Вымойте 10 см блюдо с селезенкой гомогенатах с 10 мл PBS и передачи при фильтрации.
6. Центрифуга одного клеточные суспензии, 10 мин при температуре 375 мкг и отбросить супернатант. Флик ячейки гранул, чтобы разбить существующие сгустки клеток. Добавьте 5 мл ACK буфера (табл. 1) для лизиса эритроцитов. Выдержите 5 минут и снова центрифуге при 375 х г.
7. Удалите супернатант и вновь приостановить гранулы, тщательно, но осторожно, в PBS с 2% ЭТС. Держите клетки при 4 ° C. Используйте пипеткуудаления мусора, если таковые имеются. Граф жизнеспособные клетки, используя автоматический счетчик клетки (Bio-Rad).
8. Спином вниз PBS-ресуспендировали спленоцитов в 375 мкг в течение 4 мин. Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в 4 мл полной DMEM (2 х 1 мл будет использоваться для IC анализа исходной суспензии, 0,6 мл использовать для последовательного пять раз растворение в анализе IC, 0,4 мл для вирусной ДНК и подготовка КПЦР, и 1 мл суспензии будет использоваться для оценки спонтанной реактивации латентного вируса после трех циклов замораживания-оттаивания)
9. Подготовка серийного пять раз разведения (т.е. 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250) спленоцитов суспензии в дубликатов. Заполнять 15 мл конические пробирки с 2,4 мл DMEM и разбавьте 600 мкл суспензии спленоцитов в первой пробирке и хорошо перемешать. Передача 600 мкл от предыдущих трубку в следующем трубки и т.д. Не вихрь!
10. Аспирируйте среды от подготовлены 6-а монослой клеток Веро. Семенной 1 мл серийно разбавленного спленоцитов на Vero клетках с каждого разведения duplicated (10 скважин будут использованы для 0, 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250 разведения).
11. Инкубируйте пластин 8-12 часов при 37 ° С и 5% CO _2. Не превышать 24 часов. Аспирируйте подвески посеяны спленоцитов и нагрузки 4 мл наложения средств массовой информации (табл. 1) в каждую лунку. Инкубировать 6 дополнительных дней.
12. Определить уровни селезенки инфекционных центров окраски плит с 0,2% (вес / объем) кристаллический фиолетовый, как показано в зубном налете анализа.

5. Количественная оценка вирусного генома

1. Извлечение общей геномной ДНК из γHV68-инфицированных тканях, таких как рак легких и селезенки образцы в этом эксперименте. Используйте DNeasy крови и тканей Kit (Qiagen), следуя протоколу производителя.
2. Определение концентрации ДНК каждого образца, чтобы обеспечить такое же количество ДНК используется для анализа КПЦР. Дизайн вирус-специфических праймеров (~ 200 б.п. ампликона является предпочтительным для анализа КПЦР). Мы использовали γHV68 ORF56-специфических праймеров (прямого праймера: 5 и пр.IME; - GTAACTCGAGACTGAAACCTCGCAGAGGTCC - 3 '; обратный праймер: 5'-CCGAAGCTTGCACGGTGCAATGTGTCACAG-3') для этого анализа и β-актина праймеров (прямого праймера: 5'-cacccacactgtggcccatcat-3 'обратный праймер: 5'-gtgaggatcttcatgaggtagtc-3'), как контроль за реакцией КПЦР.
3. Смешайте образец ДНК (100 - 500 нг хорошо), и соответствующие грунтовки с 2-х SYBR мастер смеси (Bio-Rad IQ SYBR Green Supermix). Используйте Bio-Rad ПЦР в реальном времени системы для количественного определения вирусной нагрузки в пораженных тканях. Выполните ПЦР на следующие условия: 95 ° C в течение 15 мин и 45 циклов 95 ° C в течение 30 мин, 60 ° С в течение 30 мин и 72 ° С в течение 30 мин, после чего кривая плавления анализ, как для вирусных и актина ампликонов.
4. Для стандартной кривой для количественного определения вирусного генома, серийно разбавленного известные количества γHV68 bacmid ДНК с геномной ДНК, выделенной из неинфицированных клеток. Запуск КПЦР параллельно с ДНК извлекается из инфекцийТед тканей с использованием того же набора вирус-специфических праймеров.
5. Настоящий вирусная нагрузка генома в тканях, как вирусная числа копий ДНК на единицу (например, 100 нг или 500 нг) геномной ДНК после актина нормализации.

6. Представитель Результаты:

На рисунке 1 представлена ​​общая схема экспериментов для измерения γHV68 инфекции у мышей в естественных условиях. Представитель результаты вируса титры в легких во время острой инфекции из γHV68, как это определено доска анализа, были показаны на рисунке 2А. Мутантного штамма γHV68 содержащие нефункциональные вирусных Bcl-2 (vBcl-2) реплицируются на уровне, сопоставимом с диким типом γHV68 в легких после 7 дней интраназального заражения BALB / с мышей (6 - 7 мышей в группе). Никаких статистически значимых различий в легких титры вируса были обнаружены между двумя группами. Эти данные показывают, что vBcl-2 не является решающим фактором для острой инфекции из γHV68 вмышей. Тем не менее, на 28 postinfection дней титр vBcl-2 мутант вируса в селезенке упал 6 - до 10 - раза по сравнению с WT, если судить по инфекционным центром анализа (рис. 2В), предполагая, что vBcl-2 мутант вируса γHV68 неисправен в поддержании селезенки задержкой после заражения. В соответствии с уменьшенным инфекционных титров центр, вирусная нагрузка генома vBcl-2 мутант вируса значительно сниженным по сравнению с WT вирусов на 28-й день в повторных экспериментах, как показано на рис 2С. Тесная взаимосвязь между вирусной нагрузкой генома и частота скрытого HV68vBcl-2 мутант вируса реактивации исключая виво в латентной стадии инфекции подчеркивает задержки недостаток этого мутанта вирусной инфекции.

Рисунок 1. Схема для измерения γHV68 инфекции у мышей с помощью зубного камня, инфекционный центр, и КПЦР анализаs.

Рисунок 2. Литические и латентной инфекции WT и мутантных γHV68 вирусов в естественных условиях. Острый репликации (А) WT и мутантных vBcl-2 γHV68 вирусов в легких мышей BALB / C мышей на 7 точек на дюйм (день после инфекции) определялось доска анализа. (В и С) селезенки инфекционных центров (B) и вирусной нагрузки генома (C) в селезенке зараженных мышей измеряли на 28 точек на дюйм инфекционными анализа центре и КПЦР, соответственно. Красные линии, средние значения указанных значений. нс, не имеет значения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

γHV68 был широко использован в качестве модели для понимания патогенеза человека γ-HVS ^2,4,5. В этом протоколе, мы описали три обычно используются методы, в том числе доска тест для инфекционного титра вируса, IC анализ на вирусную нагрузку скрытой, и КПЦР вирусной нагрузки генома, для оц...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Материал Имя	Подготовка процедур
Метилцеллюлоза (MC) наложение среда для вирусного анализа доска	Тепло ~ 250 мл дистиллированной воды в ТЦ бутылки до> 80 ° C (кипячения в течение 3 мин в микроволновой печи) Добавить постепенно 2,5 г MC порошок в нагретую воду, помешивая, на слабом огне до полного растворения. Автоклав сразу в течение 15 мин при температуре жидкого цикла. Перемешивание автоклавного СМИ MC при 4 ° С в течение ночи. Комбинат MC 250 мл среды с 2 х 200 мл MEM (Gibco-BRL) + 50 мл ФБС, чтобы дать 500 мл СМИ наложения.
Fix / пятно среда для анализа доска	0,2% (вес / объем) кристаллического фиолетового в 20% этанола.
ACK буфера Лизис	NH 4 Cl 0,15 М, KHCO 3 10 мм, 0,1 мм ЭДТА
Полное DMEM	Дульбеко изменение Орла среда(DMEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS; Invitrogen), 2 мМ L-глутамина, и 1% пенициллин-стрептомицина (Gibco-BRL).

Название реагента	Компания	Номер по каталогу
Кетамин	Sigma-Aldrich	K2753
Ксилазин	Sigma-Aldrich	X1251
Метилцеллюлоза	Sigma-Aldrich	M0512-250
2 х MEM	Life Technologies	11935
Сотовый фильтр	BD Faclon	352340
Omni ткани гомогенизатор	OMNI Международного	TH115
DNeasy крови и тканей Kit	КИПпоколения	69504
iQTM SYBRH Зеленый Supermix	BioRad	170-8882
CFX96 ПЦР в реальном времени системы	Bio-Rad	184-5072
Сотовые счетчик	Bio-Rad	145-0001
Sorvall SA-600	Thermo Scientific	096-124022