Отслеживание Гипоксическая сигнализации в Encapsulated Агрегаты сотовый

Резюме

Метод фото-инкапсуляции клеток в сшитый гидрогель ПЭГ описан. Гипоксическая сигнализации в инкапсулированные мышиной инсулиномы (MIN6) агрегатов отслеживать с помощью флуоресцентного маркера системы. Эта система позволяет серийный изучения клеток в гидрогель эшафот и корреляции гипоксического сигнализации с изменениями в клеточный фенотип.

Аннотация

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic β-cells results in loss of insulin production and potentially lethal hyperglycemia. As an alternative treatment option to exogenous insulin injection, transplantation of functional pancreatic tissue has been explored^1,2. This approach offers the promise of a more natural, long-term restoration of normoglycemia. Protection of the donor tissue from the host's immune system is required to prevent rejection and encapsulation is a method used to help achieve this aim.

Biologically-derived materials, such as alginate³ and agarose⁴, have been the traditional choice for capsule construction but may induce inflammation or fibrotic overgrowth⁵ which can impede nutrient and oxygen transport. Alternatively, synthetic poly(ethylene glycol) (PEG)-based hydrogels are non-degrading, easily functionalized, available at high purity, have controllable pore size, and are extremely biocompatible,^6,7,8. As an additional benefit, PEG hydrogels may be formed rapidly in a simple photo-crosslinking reaction that does not require application of non-physiological temperatures^6,7. Such a procedure is described here. In the crosslinking reaction, UV degradation of the photoinitiator, 1-[4-(2-Hydroxyethoxy)-phenyl]-2-hydroxy-2-methyl-1-propane-1-one (Irgacure 2959), produces free radicals which attack the vinyl carbon-carbon double bonds of dimethacrylated PEG (PEGDM) inducing crosslinking at the chain ends. Crosslinking can be achieved within 10 minutes. PEG hydrogels constructed in such a manner have been shown to favorably support cells^7,9, and the low photoinitiator concentration and brief exposure to UV irradiation is not detrimental to viability and function of the encapsulated tissue¹⁰. While we methacrylate our PEG with the method described below, PEGDM can also be directly purchased from vendors such as Sigma.

An inherent consequence of encapsulation is isolation of the cells from a vascular network. Supply of nutrients, notably oxygen, is therefore reduced and limited by diffusion. This reduced oxygen availability may especially impact β-cells whose insulin secretory function is highly dependent on oxygen^11-13. Capsule composition and geometry will also impact diffusion rates and lengths for oxygen. Therefore, we also describe a technique for identifying hypoxic cells within our PEG capsules. Infection of the cells with a recombinant adenovirus allows for a fluorescent signal to be produced when intracellular hypoxia-inducible factor (HIF) pathways are activated¹⁴. As HIFs are the primary regulators of the transcriptional response to hypoxia, they represent an ideal target marker for detection of hypoxic signaling¹⁵. This approach allows for easy and rapid detection of hypoxic cells. Briefly, the adenovirus has the sequence for a red fluorescent protein (Ds Red DR from Clontech) under the control of a hypoxia-responsive element (HRE) trimer. Stabilization of HIF-1 by low oxygen conditions will drive transcription of the fluorescent protein (Figure 1). Additional details on the construction of this virus have been published previously¹⁵. The virus is stored in 10% glycerol at -80° C as many 150 μL aliquots in 1.5 mL centrifuge tubes at a concentration of 3.4 x 10¹⁰ pfu/mL.

Previous studies in our lab have shown that MIN6 cells encapsulated as aggregates maintain their viability throughout 4 weeks of culture in 20% oxygen. MIN6 aggregates cultured at 2 or 1% oxygen showed both signs of necrotic cells (still about 85-90% viable) by staining with ethidium bromide as well as morphological changes relative to cells in 20% oxygen. The smooth spherical shape of the aggregates displayed at 20% was lost and aggregates appeared more like disorganized groups of cells. While the low oxygen stress does not cause a pronounced drop in viability, it is clearly impacting MIN6 aggregation and function as measured by glucose-stimulated insulin secretion¹⁵. Western blot analysis of encapsulated cells in 20% and 1% oxygen also showed a significant increase in HIF-1α for cells cultured in the low oxygen conditions which correlates with the expression of the DsRed DR protein.

протокол

1. PEGDM синтеза и фотоактивных PEGDM макромера приготовления раствора

1. Взвесьте 2g ПЭГ (линейный, 10000 Da) в 40 мл флакон стекло с жестким пластиковым колпачком.
2. Добавьте примерно 308μL метакриловой ангидрида и свободно колпачок флакона.
3. Микроволновая флакон на высоко в течение 2 минут в стандартной бытовой микроволновой печи. Ношение теплостойкие перчатки, тщательно вихрь флаконе, то микроволновая печь на высоко в течение еще 5 минут.
4. Кратко позволяют флакон для охлаждения достаточно, чтобы обращаться с перчатками. Открывать его и медленно добавить метиленхлорид в то время как закрученной флаконе. Добавить настолько, что решение представляется ясным и однородной, вортексе образца по мере необходимости. Общий объем метиленхлорид использоваться, должны быть 1,5 - 2 мл.
5. Осадок PEGDM в 200 мл холодной, перемешивают диэтиловый эфир, добавляя по каплям раствор.
6. Сбор PEGDM путем вакуумной фильтрации и дайте ему высохнуть.
7. Растворите в PEGDM достаточное количестводеионизированной воды (как правило, 100 -150 мл).
8. Диализировать решение против деионизованной воде в течение 5 дней у диализных трубок с молекулярной массой отсечки в 1000 Da. Замените воду один раз в день.
9. Алиготе решение в соответствующие контейнеры и заморозить при -80 ° С в течение ночи. Lyophilize решение в течение 4 дней для получения очищенного белого порошка PEGDM. Хранить порошок при температуре 4 ° С, когда он не используется.
10. Чтобы приготовить раствор фотоактивных PEGDM, сначала подготовить 0,5 мас фотоинициатора маточный раствор путем растворения Irgacure 2959 в деионизованной воде. Вихревые решения и хранить его в темноте.
11. Подготовка 10 мас PEGDM% и 0,025% масс Irgacure 2959 решение в сбалансированном солевом растворе Хэнка (HBSS). Vortex полностью, чтобы обеспечить растворение PEGDM. Как правило, мы подготовить 1 мл этого раствора за один раз.
12. Стерилизовать раствор путем фильтрации через фильтр 0,2 мкм в шприц 1,8 мл трубки микроцентрифужных. Оберните трубки в алюминиевой фольгеи хранят при температуре 4 ° C

2. Культура, инфекции, и агрегации MIN6 клетки

1. MIN6 клетки культивируют в RPMI 1640 с добавлением 10% FBS, 7мм глюкозы, 100 ед / мл пенициллина / стрептомицина и 0,5 мкг / мл amphotercin B во влажной среде при температуре 37 ° С и 5% CO _2.
2. Чтобы освободить из клетки обрабатываемой поверхности колбы культуры, аспирация среды, промыть ячейки с 37 ° C кальций / магний без HBSS, аспирация HBSS, затем добавить 2 мл 37 ° C трипсина-EDTA решения и позволяют клеткам инкубировать в течение 3 минут.
3. Твердо банку сторону колбы стучать клетки бесплатно, затем добавить 8 мл 37 ° C средних и энергично пипетки клеточной суспензии вверх и вниз, стараясь не ввести пузыри.
4. Внесите клеток в стерильных 15 мл центрифужную пробирку и выполнять клеток использованием гемоцитометра или другие процедуры подсчета клеток.
5. При подготовке для заражения клеток с производителемВирус сначала необходимо определить общее количество ячеек, которые будут инфицированы и рассчитать объем суспензии вируса, необходимых для достижения желаемого множественности заражения (МВД) (50 до 100 инфекционных частиц на клетку).
6. Развести вируса в HBSS, тщательно pipeting необходимое количество суспензии вируса в предварительно аликвоты объемом HBSS в 1,8 трубки микроцентрифужных мл. 50 мкл HBSS на лунку агрегирования клеток необходимо.
7. Дисперсные клеток pipeting их вверх и вниз в трубки, а затем пипеткой необходимый объем для достижения 400 000 клеток на лунку в лунки 6-луночный планшет культуры подвески.
8. Добавить соответствующий объем разбавленного вируса в каждую лунку для достижения желаемого МВД.
9. Добавить среду в каждую лунку, чтобы довести общий объем до 1,7 мл.
10. Место пластину на орбитальный шейкер внутри инкубатора. Установить шейкер на низкое значение, так что средний нежно моет вокруг скважин (~ 100 оборотов в минуту). Разрешить клетки агрегацииТе для 24-36 часов. Агрегаты с приблизительным диаметром 75-175 мкм должна быть сформирована.

3. Инкапсуляции клеток в PEGDM

1. Ячейки могут быть воплощен в виде дисперсии (шаг 2.4) или после агрегации (шаг 2.10). С PEGDM гидрогеля предшественником решение жидкость, клетки могут оседает до сшивания и гидрогель образования. Если урегулирование как ожидается, произойдет быстро, например, с более крупными агрегатами, это может быть полезно для получения гидрогеля в два этапа, так что клетки оседают на центральной плоскости геля. Один шаг гидрогеля синтеза процедура подходит для рассеянных клеток показано на рисунке (рис. 2) и двухступенчатая процедура показана, а также (рис. 3) и подробно описаны ниже (3.2-3.9).
2. Создать сосуд, в котором гидрогель будет формироваться за счет сокращения конический наконечник офф 1 мл пластиковый шприц и размещение его в открытом конечном итоге в стойку.
3. Внесите 20 мкл фотоактивных PEGDM такlution в открытый конец шприца на поршень убедившись, что объем покрывает всю поверхность поршня. Отрегулируйте поршень с небольшим шагом для достижения ровной поверхности жидкости.
4. Место пипетки в стойку и положение стойки под УФ-лампы (365 нм, ~ 7 мВт / см ²⁾ в течение примерно 8 минут, чтобы дать для гидрогеля сшивания. За это время подготовки клетки могут быть начаты
5. Внесите том, содержащий необходимое количество клеток / агрегатов в 1,8 трубки микроцентрифужных мл, крышки, и центрифуга трубке при 130 г в течение 5 минут.
6. Использование micropipettor, осторожно удалите СМИ, не нарушая клеточный осадок на кончике трубки. Как сообщил руководитель медиа подходы гранулы, оно может быть полезно использовать более тонкий, 10 мкл кончиком пипетки.
7. Аккуратно ресуспендируют осадок клеток в 20 мкл фотоактивных PEGDM решение (использовать широкий рот пипеткой наконечник, если работать с агрегатами) и добавить клеточной суспензии в шприц сверху-йэлектронной ранее сшитый гидрогель части.
8. Expose шприц, чтобы еще 8 минут ультрафиолета для завершения строительства гидрогеля. Когда закончите, клетки должны быть полностью инкапсулируется в цилиндрических гидрогеля (рис. 3).
9. Извлечь гидрогель из шприца и в 1 мл HBSS в скважине 24-луночного планшета кратко мытья гелем. Передача геля 1 мл средства массовой информации в лунку 24-луночного планшета и культуры под требуемым условиям.

4. Гипоксия слежения

1. В любой момент в течение культуру, образ клетки с помощью флуоресцентной микроскопии для отслеживания начала гипоксического сигнализации. В зависимости от того, что вы можете отображаемого изображения в мульти-луночного планшета или передачи гель на предметное стекло микроскопа до размещения на столике микроскопа. Пик возбуждения Ds Красной достигается при 556nm и пик излучения приходится на 586nm. Эмиссия является довольно интенсивным и, таким образом фотообесцвечивания не наблюдаемыеред проблематичным. Временной лаг между началом производства белка и первое обнаружение сигнала составляет примерно 12 часов. Сигнал достаточно конкретным, чтобы выявить отдельные сигнализации клеток, но разрешение может быть недостаточно для определения внутриклеточной локализации сигнала. В сигнализации клетки, сигнал, как правило, наблюдается равномерно по всей цитоплазме. Интенсивность сигнала может также увеличить с расширенной экспозиции к гипоксии, хотя мы еще не полностью определены, если это из-за увеличения экспрессии белка, в целом накопление белка, или задержка созревания белка.

5. Представитель результаты

Типичный пример MIN6 агрегатов инкапсулированных в гидрогель PEG показано на рисунке 4. Сшитый гель будет твердой всему, принимая форму сосуда, в котором реакция была выполнена. Гель с гладкой внешней поверхности предпочтительнее для имплантации, чтобы помочь в предотвращении иностранной валюты телаотклика. В гель, клеточных агрегатов должно быть полностью закрыто в матрице и однородно распределенные для обеспечения лучшего перенос питательных веществ.

Представитель изображений гипоксических сигнализации в MIN6 агрегаты изображенный на рисунке 5. Идентичные MIN6 агрегатов инфицированных вирусом маркер культивировали в любом 20% O ₂ (5а) или 1% O ₂ (5, б) в течение 44 часов до захвата изображения.

Рисунок 1. Схема деятельности нашей гипоксии системы маркеров. Аденовирусные вставки Ds Красной DR гена и вверх по течению HRE промоутера позволяет гипоксия-индуцированный производство флуоресцентного белка под контролем HIF-1.

Рисунок 2. Процедурные схема для пошагового инкапсуляции дисперсных MIN6 клеток в крosslinked PEGDM гидрогеля. Для каждого гель, рассеяны клетки взвешены в 40μL из макромера решение PEGDM фотоактивных. Это находится в обезглавленной 1 мл шприц и гидрогель образуется при 365 нм УФ-светом через 10-12 минут. После завершения гидрогеля диск удаляется из шприца, промывают и помещают в среду заполненные луночный планшет для инкубации.

Рисунок 3. Процедурные схема для двойного шага инкапсуляция агрегированных MIN6 клеток в сшитый PEGDM гидрогеля. Для каждого гель, полу-гель прежде создан УФ сшивание 20 мкл макромера фотоактивных PEGDM решение в течение 8 минут. MIN6 агрегатов тщательно взвешенные в дополнительные 20 мкл фотоактивных макромера решение, которое добавляется в верхней части предварительно сформированных полу-гель. Полный геля формируется еще 8 минут ультрафиолетового облучения с агрегатами полностью инкапсулируются в медиальнойплоскости геля.

Рисунок 4. Изображение 40μL гидрогеля под 20-кратным увеличением. MIN6 агрегаты (~ 400 тысяч общего числа клеток) отчетливо видны в гель. Гидрогель диаметром примерно 6 мм (бар = 1 мм).

Рисунок 5. Флуоресцентные гипоксии сигнализации в агрегированном MIN6 клеток в PEGDM гидрогеля. Клетки, которые инкапсулируются и затем помещаются в инкубации при 20% O ₂ в течение 44 часов не отображаются гипоксии сигнализации (), тогда как клетки, которые были инкапсулированные затем инкубировали в 2% O ₂ в течение 44 часов дисплей ясно, повсеместного сигнала. (Бар = 100 мкм) (б).

Обсуждение

Метод, представленный здесь предлагает быстрый и простой метод для сотовых инкапсуляции в гидрогель ПЭГ с минимальным использованием не-физиологических условиях. ПЭГ представляет собой очень полезный материал для инкапсуляции его биосовместимость и простота модификации. Простое изменение PEG процент в светочувствительный раствор, например, может быть использован для настройки механические свойства, такие как сжатие модулем и транспортные свойства через размером пор. Кроме того, ПЭГ легко модифицируется путем добавления боковых цепей. PEG гидрогели, следовательно, представляют собой как перспективный клинический устройства и гибкую платформу для лабораторного исследования

Метод для слежения за гипоксии в ПЭГ-инкапсулированные клетки также были представлены. Этот метод полезен для простоты гипоксии обнаружения и для избежания необходимости жертвовать клетки интерес. Методика может быть применена к различным типам клеток в различных условиях вносит свой намиefulness широк. Например, гипоксия, как реплика для стволовых дифференцировки клеток могут быть отслежены в стволовых клеточных культур Micromass. Однако этот метод может быть применен только для разгона клеточные системы или системы, в которой рассеяны клетки позже суммируются. Кроме того, обнаружение флуоресцентного сигнала может быть затруднено в большей или плотной ткани.

Материалы

Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии (необязательно
ПЭГ	Sigma-Aldrich	309028-500G
Метакриловой ангидрид	Sigma-Aldrich	276 685-100мл
Микроволновая печь	Эмерсон	MW8784SB
Vortexer	Научно Industries	SI-A236
Метиленхлорид	Sigma-Aldrich	D65100-1L
Диэтиловый эфир	Sigma-Aldrich	346 136-1L
Диализ труб	Спектр	132640
	Лаборатории
Морозилка
Лиофилизатор	Labconco	7670521
Вакуум-насос	Скрываться, не уплатив проигрыша	8917Z-01
Irgacure 2959	Ciba-Geigy	029891301PS04
HBSS	Mediatech	21-022-CV
Шприц фильтр	VWR	28145-477
RPMI 1640	Mediatech	*	* Пользовательские разработки
FBS	ПАА лаборатории	А15-351
Пенициллин-Стрептомицин	Mediatech	30-002-ДИ
Амфотерицин	Mediatech	30-003-CF
Инкубатор	Thermo Scientific	3597	Napco серии 8000 WJ ж / O2 подавления
Трипсин ЭДТА	Mediatech	25-052-ДИ
Орбитальный Шейкер	VWR	12620-926
УФ-лампы	Sanyo Denri	FLR40SBLB / M	Имеет два 40 Вт, 365 нм Blacklight синий луковицы УФ
Центрифуга	Эппендорф	5811 000.010 *	* Номер заказа. Модель 5810 R
Микроскоп	Nikon	TI-ND6-PFS	С filterset для 556nm возбуждения / излучения 586nm