Грызун стереотаксической хирургии и животных улучшения благосостояния Итоговом документе Поведенческие Neuroscience

Резюме

Стереотаксической хирургии на грызунов позволяет целевой прием препаратов или электрической стимуляции и записи у бодрствующих, которые ведут себя животные. В этом видео-презентации мы продемонстрируем последние процедурные уточнения к этой давней процедура, которая успешно улучшение выживаемости и снижения послеоперационной потери веса.

Аннотация

Стереотаксической операции по имплантации катетеров в конкретных областях мозга в течение многих десятилетий была очень успешной экспериментальной методики изучения влияния локально управлять нейромедиаторов и сигнальных путей у бодрствующих, которые ведут себя животные. Более того, стереотаксической имплантации электродов для стимуляции и электрофизиологические исследования записи сыграл важную роль в нашем современном понимании нейропластичности и мозг сетей в себя животных. Постоянно растущее знания об оптимизации хирургической техники у грызунов ^1-4, информирование общественности по вопросам благополучия животных и жесткое законодательство (например, в 2010 году Директива Европейского союза об использовании лабораторных животных, ⁵⁾ предложено уточнить эти хирургические операции, особенно в отношении для внедрения новых процедур для кислородных добавок и непрерывного мониторинга оксигенации крови и уровня частоты сердечных сокращений во время операции, а такжевведение стандартизированного протокола для послеоперационного ухода. Наши наблюдения показывают, что эти изменения привели к увеличению выживаемости и улучшение общего состояния животных после операции (например, менее потеря веса и более активных животных). Это видео презентация покажет общие процедуры, связанные с этим типом стереотаксической хирургии с особым вниманием к нашим нескольких модификациях. Проиллюстрируем эти хирургические операции у крыс, но это также можно выполнять такого рода операции у мышей и других мелких лабораторных животных с помощью специальных адаптеров для стереотаксического аппарата ^6.

протокол

Примечание: Антисептическое методы должны быть использованы в течение всей процедуры. Все инструменты и материалы (хлопок-тампоны, марлевые и т. д.), который будет использоваться во время операции следует стерилизовать в автоклаве. Хирургическую маску, волосы капота и стерильные перчатки. Рабочую зону и стереотаксической аппарата должны быть тщательно очищены и продезинфицированы 70% растворе этанола.

1. Предварительно хирургических процедур

1. Настройка стереотаксического аппарата и всех необходимых материалов. Предварительно теплые грелки.
2. Место канюли в свою поддержку и проверить, если это прямо.
3. Включите газовой системы - смесь воздуха и кислорода (30-35% от общего потока должны быть кислорода).
4. Взвесьте крысы и управлять анестезией. Мы используем смесь кетамина (37,5 мг / кг) и dexmedetomidine (0,25 мг / кг) вводили подкожно. Для разных протоколов анестезии см. Flecknell ⁴ и Hellebrekerс соавт. ^7.
5. После крыса потеряла сознание, бритье головы область переходе от ушей, чтобы всякий между глаз электробритву.
6. Место крысы на грелку, с его носа перед шлангов. Используйте оксиметр для того, чтобы крыса адекватный уровень оксигенации крови (не должна падать <90%). Пожалуйста, следуйте инструкциям производителя по надлежащему использованию оборудования.
7. Применять крем для глаз (Duratears Z, Alcon) с обеих роговицы, чтобы избежать обезвоживания.
8. Проверить рефлексы крыс (хвост рефлекс или ног-пинча рефлекс, как показано в Walantus и соавт. ^8), чтобы убедиться, что он адекватно наркозом. Если крыса продолжает показывать сильные рефлексы, восполнение анестезия может быть необходимо.
9. Если ни один носок-пинча рефлекс показано, место крысы в ​​стереотаксической аппарат, настроить ухо баров, так что она показывает, равное чтению с двух сторон, и место снова шлангов перед животными, фиксируя его с носом бар. Проверьте еще раз, если крыса показывает уровень оксигенации крови на 90% или выше. Если нет, либо настроить труб, приближая его к носу, или увеличить поток кислорода. Монитор уровень оксигенации крови и частоты сердечных сокращений всей операции.
10. Постоянно следить за температурой крысы с ректального термометра (преимущественно связаны с грелку) и записывать значения в начале и в конце операции. Отрегулируйте грелку или использовать одеяло для поддержания температуры тела 37,5 до 38,5 ° C.

2. Хирургия

1. Inject анальгетик. Мы используем одну пери-оперативном управлении carprofen (4,0-5,0 мг / кг, подкожно). Для разных анальгетик протоколов см. Hellebrekers и соавт. ^7.
2. Чистая бритой области тОн кожи от центра к периметру волосы в три раза с дезинфицирующим раствором (например, хлоргексидин 0,5%) и на местах вводят смесь лидокаина (20 мг / мл) и адреналина (5 мг / мл) для местной анестезии и вазоконстрикции (для предотвращения чрезмерное кровотечение).
3. Убедитесь передне-задний разрез около 2,5 см по средней линии головы, переходя от между глаз до задней части ушей. Используйте 4-6 зажимов бульдога с отщипывать кожу и держать разрез открытым. Удалите любые соединительной ткани с помощью шпателя и / или ватные тампоны и чистой области, чтобы разоблачить поверхности черепа.
4. Убедитесь, что голова уровня: во-первых, найти Lambda и место руководства канюли точно на этом месте, касаясь черепа. Запись дорзо-вентральной координат. Далее, поместите руководство канюли точно над брегмы, касаясь черепа, и записать его дорзо-вентральной координат. Эти две координаты должны быть идентичными. Если разница составляет> 0,3 мм, отрегулируйте нос бар, чтобы исправить ее.
5. Маке два маленьких отверстия для крепления черепа винты с помощью стерилизованных ручная дрель (одна около 5 мм впереди расположение канюли в одном из полушарий и другие 5 мм кзади от места канюли в контралатеральной полушарии). Поместите два стерильных винты в эти отверстия, пока они не плотно закреплены, не будучи вставлен полностью в череп.
6. С руководством канюли помещается ровно в темя, запись передне-задней и боковой координаты. Нужное место размещения руководство канюли для каждой области мозга, может быть вычислена путем сложения или вычитания из брегмы, с помощью стереотаксической атлас ^9-11.
7. Позиция руководства канюли в правильном месте, слегка касаясь черепа. Запись дорзо-вентральной координат. Для двустороннего размещения канюли, найти следующий расположение канюли в другом полушарии, и снова записывать дорзо-вентральной координат. Обе координаты должны быть одинаковыми (или различаться <0,3 мм).
8. Марк канюли местах на череп с карандашом и стерильные, с стороны бурильщика, чтобы заусенцы отверстий, проверяя размеры и правильное расположение с помощью руководства канюли. Как только отверстия сделаны, используйте стерильные иглы, чтобы мягко удар мозговых оболочек, чтобы обеспечить беспрепятственное вставки канюли.
9. Место канюли в первое отверстие и опустите его тщательно, пока не достигнет окончательного вентральной координат. Подготовка стоматологического цемента и щедро применяют его вокруг канюли и один или оба винта для закрепления канюли. Подождите, пока цемент полностью высохла. После этого осторожно удалить канюлю поддержки поворотом дорзо-вентральной вверх бар.
10. Место второго канюли в поддержке и перейдите в папку канюли в другом полушарии. Место канюли в отверстие и повторите предыдущий шаг. Обложка винты и большая поверхность канюли с цементом, и перед цемента сухим, удалите излишки с поверхности кожи.
11. Inject теплой (~ 37 ° С) стерильного физиологического раствора (~ 10 мл / кг, подкожно), чтобы обеспечить регидратации.
12. После цемента полностью высохла, удалите поддержку канюли и место стерильную штифт в каждом канюлей для предотвращения обструкции.
13. Чистая области раны стерильным физиологическим раствором и шовные передней и задней раны.
14. Удалить животное от стереотаксической аппарат, заменяя газ трубы перед ее носом. Продолжайте следить за уровнем насыщения крови кислородом и температуру тела.
15. Если инъекционных анестетиков с dexmedetomidine используется, вводят его антагонист атипамезола (0,25 мг / кг, подкожно) и подождите, пока животное просыпается (примерно 5 минут).
16. Место крысы в ​​клетке восстановления. Чтобы избежать переохлаждения, место клетке в термостате при 28 ° С или на грелку на место, где можно наблюдать животных в течение по крайней мере один час, прежде чем вернуться его в виварий комнате.

3. Послеоперационный уход

1. Во время Первые 4 дня после операции, контролировать восстановление крысы, сохраняя ежедневные записи вес и другие замечания, касающиеся состояния животных в лабораторных журналах или "животных дневники".
2. Животные, которые показывают явных признаков болезни, инфекции раны, потеря массы тела или другими признаками уменьшения благосостояния, должны пройти специальный уход: например, дополнительные дозы анальгетиков чтобы свести к минимуму послеоперационные боли, смесь пищевого порошка и воды в дополнение к стандартным кормом для стимуляции аппетита крысы, и / или подкожной инъекции физиологического раствора для поддержки регидратации.
3. Если крыса не показывает каких-либо улучшений после этих вмешательств, или потеря массы тела> 15% (по сравнению с предварительно хирургии веса), жертвоприношение животного с передозировка анестетика (гуманный конечная точка).
4. Крысы обычно нужно восстановить в течение по крайней мере 7 дней до начала поведенческие эксперименты.

4. Представитель Результаты

jove_content "> Для определения того, различные изменения в нашей хирургической процедуры, в частности в отношении добавок кислорода и непрерывного мониторинга оксигенации крови уровня, частота сердечных сокращений и температуры тела, повышение выживаемости животных и улучшение ее общего состояния после операции, мы сравнили без выживаемость 20 когорт животных (состоящий из 20 крыс каждой), которые сделали операцию после того, мы реализовали эти изменения с не-выживаемость 24 когорт (20 крыс каждая) эксплуатируются со стандартным протоколом. Как показано на рисунке 1а , без выживаемости был значительно сокращен в выборке когорты, что была сделана операция с измененным протоколом (P <0,05; Mann-Whitney U тест, два хвостами). Кроме того, как показано на рисунке 1b, послеоперационной потери веса крыс работает с модифицированный протокол был также значительно сокращены по сравнению с крысами работает со стандартной процедурой (послеоперационный день 1: P <0,05; послеоперационный день 2: Р <0,01; послеоперационный день 3: P = 0,17; Студенческая т-тестов).

Рисунок 1. Влияние хирургического изменения на не-выживаемость и после хирургического снижения веса. (А.) Номера для выживаемость крыс работать с измененной протоколом по сравнению с крысами работает со стандартным протоколом. Без выживаемость (медиана ± межквартильный диапазон) был рассчитан как процент крыс, в когорте из 20 крыс, которые не пережили операцию. * Р <0,05, Mann-Whitney U тест два хвостами (п = 20 когорт для модифицированного протокола и 24 когорт по стандартному протоколу). (Б) Потеря веса (среднее ± SEM в процентах перед операцией вес) во время первого (POD1), второго (POD2) и третьего (POD3) послеоперационный день. * P <0,05, ** P <0,01, студент т-тест (п = 60 в группе).

Обсуждение

Основная цель этого видео-презентации является ознакомление поведенческого нейрофизиологи с основными принципами стереотаксической хирургии. Исследователи, которые уже выполняет стереотаксической хирургии может также извлечь выгоду из этого видео и рассмотрим некоторые из процед...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания
Алкоголь 70%	VWR
Antisedan (атипамезола)	Орион
Атропин сульфат 0,5	Pharmachemie BV
Бульдог кровоостанавливающим зажимом	Aesculap
Канюли	Компонент Prim, SRL
Хлоргексидин 0,5%	AppepPharma
Чистящий порошок	Алконокс
Хлопок палочки	Hartmann BV
Dexdomitor (dexmedetomidine)	Орион
Дрель	Dremel 8000
Duratears Z	Alcon
Durogrip Naaldvoerder обратное 130мм	Aesculap
Durotip Fijne schaar ret.sp / ст 110 мм	Aesculap
Марля	Medicomp (5x5)
Грелка-подушка	Гарвардский аппарата
Насекомые штифты (стилеты)	Entosphinx (Чехия)
Кетамин 10% (кетамин)	Alfasan
Микро-Halsted прямой наконечник	Aesculap-ветеринара
Molinea	Hartmann BV
NaCl 0,9%	Бакстер
Иглы (25G)	Terumo
Оксигемометр	Эдена Instruments, Inc
Пентобарбитал	Аптека UMCG
Римадил	Pfizer
Лезвие скальпеля № 23	Сван Мортон
Scalpelholder NR. 4 133 мм	Aesculap
Отвертка	обычный магазин бытовой техники
Simplex Rapid (зубной цемент)	Kemdent
Череп винты	Компонент Prim, SRL
Шпатель	VWR
Spongestan специальные	Johnson & Johnson
Stereotacts	Kopf инструменты
Хирургические щипцы 100 мм	Aesculap
Шовный материал Safil 5 / 0	Aesculap
Шприц 10 мл	Omnifix
Шприц 1 мл	Terumo
Шприц 5 мл	Omnifix
Xylocaine (лидокаина / адреналина)	Astra Zeneca