Выделение мышиные клетки легких Дендритные

Резюме

Высоко очищенного препарата мышиные клетки легких дендритных описано. Особое внимание уделяется изоляции обычных дендритных подмножество клеток.

Аннотация

Легкого дендритные клетки (ДК) играют фундаментальную роль в зондирование вторжения патогенов ^1,2, а также в управление вызывающий иммунологическую толерантность ответы ³ в дыхательных путях. По крайней мере, три основных подмножеств клеток легких дендритных были описаны у мышей: обычные DC (CDC) ^4, plasmacytoid DC (PDC) ⁵ и ИФН-убийца производства DC (IKDC) ^6,7. Подмножество CDC является наиболее известным DC подмножество в легких ^8.

Общий маркер для выявления известных DC подмножеств CD11c, типа я трансмембранного интегрина (β2), что также выражается в моноциты, макрофаги, нейтрофилы и некоторых В-клетки ^9. В некоторых тканях, используя CD11c в качестве маркера для выявления мыши DC действительно, как и в селезенке, где большинство CD11c ^{+ клеток} представляют собой подмножество CDC который выражает высокий уровень главного комплекса гистосовместимости II класса (MHC-II). Тем не менее, легкие более разнородной ткани, где будетстороны DC подмножества, есть большой процент различных популяции клеток, что выражается высоким уровнем CD11c бой низкого уровня MHC-II. Опираясь на свои характеристики и в основном на его выражение F4/80, селезенки маркер макрофагов, CD11c ^привет MHC-II ^вот легкого населения была определена в качестве легочных макрофагов 10 и совсем недавно, в качестве потенциального предшественника DC ^11.

В отличие от мыши PDC, изучение специфической роли CDC в легочной иммунный ответ был ограничен из-за отсутствия специфического маркера, который может помочь в изоляции этих клеток. Таким образом, в этой работе мы описываем процедуру, чтобы изолировать высокой степени очистки мыши легких CDC. Изоляция легочных подмножества DC представляет собой весьма полезный инструмент, чтобы получить представление о функции этих клеток в ответ на возбудителей инфекций дыхательных путей, а также экологические факторы, которые могут вызвать иммунный ответ в легких.

протокол

1. Перфузии легких и суспензии отдельных клеток

1. Эвтаназии мышь с внутрибрюшинного введения кетамина / ксилазина смеси анестетиков (в мг / мышь кетамин 1.8, ксилазина 0,19) и обескровливание через бедренную вену
2. Expose грудной полости за счет сокращения и осторожно потянув назад внешняя оболочка брюшины. Приступить к открытой диафрагмы за счет сокращения грудной клетки, чтобы выставить как сердце и легкие.
3. Заливать мягко легких использованием 5 мл шприц с ЭДТА-HBSS (1 мм ЭДТА кальция / магния без HBSS). Подключите 25 G иглу и вставить иглу в правый желудочек. Для предотвращения утечки во время инъекции, безопасные myocardiac ткань вокруг иглы с помощью щипцов. Осторожно вводят раствор при сохранении постоянного давления. Точная перфузии приведет к инфляции, легких и изменение цвета на розовый / белый.
4. Удалите дренаж лимфатических узлов, чтобы отказаться от любого возможного загрязнения из этой ткани.
5. Собиратьлегочной ткани, трансфер в чашке Петри на льду, и нарезать его на небольшие части, используя лезвие бритвы.
6. Передача заземленной ткани в трубке gentleMACS С, содержащий 5 мл / легких коллагеназы решение пищеварения (коллагеназы типа 1А 0,5 мг / мл плюс тип IV бычьей панкреатической ДНКазы 20 мкг / мл в HBSS, содержащего 5% FBS, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина).
7. Используйте диссоциатор gentleMACS для получения суспензии отдельных клеток. Выберите программу: m_lung_01. Инкубируйте образца при 37 ° С в течение 30 минут. Встряхните трубку каждые 5 минут для ресуспендирования фрагментов тканей. Приступить к программе m_lung_02.
8. Передача образца до 15 мл коническую трубку и центрифуги в течение 10 минут при 335 х г при 4 ° C. После этого шага, сохранить все реагенты и центрифугирования при 4 ° С до предотвратить снижение жизнеспособности клеток.
9. Удалите супернатант и лизиса оставшихся эритроцитов, добавив 2 мл ACK лизирующего буфера в течение 1 минуты при комнатной температуре. Вымойте клеток с 13мл холодной PBS/0.5% BSA и центрифуги в течение 10 минут при 335 х г при 4 ° C.
10. Удалите супернатант, ресуспендируют общего числа клеток в 5 мл холодной PBS/0.5% BSA и проходят тщательную 100 мкм нейлоновая сетка.
11. Определите общее количество клеток с помощью трипанового синего исключения красителя.

2. Магнитная изоляция и CD11c ^{+ клеток} обогащения

1. Центрифуга суспензии отдельных клеток в течение 10 минут при 200 х г при 4 ° С и отбросить супернатант.
2. Ресуспендируют осадок клеток в 400 мкл буфера разделения (PBS, 0,5% BSA, и 2 мМ ЭДТА) в 10 ⁸ общего числа клеток. Блок Fc-опосредованная неспецифического связывания антител с помощью anti-CD16/CD32 антител (0.5μg / 10 ^{6 клеток)} в течение 30 минут при 4 ° C.
3. Вымойте клеток с 10 мл холодного буфера разделения и центрифуги в течение 10 минут при 200 х г при 4 ° C. Ресуспендируют клеток в 400 мкл разделения буфера.
4. Добавить 100 мкл CD11c микрошарики в 10 ⁸ общего числа клеток. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 минут в холодильнике (2-8 ° С).
5. Вымойте клеток с 10 мл холодного буфера разделения и центрифуги в течение 10 минут при 200 х г при 4 ° С и отбросить супернатант.
6. Ресуспендируют клеточный осадок в 3 мл холодного буфера разделения.
7. Выполните магнитной сепарации использованием autoMACS Pro ^TM сепаратор, выбрав программу posseld. Сбор положительную фракцию (0,5 мл).

3. Обычная клетка дендритные (CDC) изоляции

1. Инкубируйте обогащенный CD11c положительные суспензии клеток с анти-CD11c PE-Cy7 и anti-IA/IE (MHC-II)-FITC антител в течение 30 минут при 4 ° C. Оптимизированная концентрации антител составляет 0,5 мкг / 10 ⁶ клеток.
2. Вымойте клетки с холодной PBS/0.5% BSA и центрифуги в течение 10 минут при 335 х г при 4 ° C. Ресуспендируют клеток в 0,5 мл PBS/0.5% BSA и передает их через 40 нейлоновая сетка мкм.
3. Переходите ксортировать клетки с помощью ячейки FACS Ария сортировщик в чистоте режиме. Добавить 100 мкл PBS/0.5% BSA в коллекцию трубы, чтобы предотвратить повреждение очищенных клеток. Держите ваши клетки в охлажденном температуру на протяжении всего процесса сортировки клеток.

4. Альтернативный протокол для получения суспензии отдельных клеток и CD11c + клеток обогащения

1. В замены диссоциатор gentleMACS, основанные легочной ткани с шагом 1,5 могут быть переданы в 15 мл коническую пробирку, содержащую 5 мл коллагеназы раствора на легких и инкубировать в течение 1 часа при температуре 37 ° C. Vortex клетки каждые 15 минут, чтобы ресуспендирования фрагментов тканей. Disrupt ткани при прохождении пробы 6-8 раза и через 3 мл шприца, соединенного с иглой 20 G. Избегайте пузырей в процессе, в противном случае жизнеспособность клеток будут поставлены под угрозу. После суспензии отдельных клеток, получается, переходите к шагу 1.8.
2. В замены AutoMACSPro ^ТМ разделениятор, магнитная изоляция для обогащения CD11c клеток, также может быть выполнена путем пропускания клеточной суспензии вручную через два MACS столбцов. Выбор соответствующих столбцах будет варьироваться в зависимости от размера выборки.

5. Представитель Результаты:

Легкого CDC определены как CD11c ^привет / MHC-II ^привет клеточной популяции. Как показано на рис. 1, CDC представляют меньший процент на 1,4% по сравнению с некоторыми другими тканями, таких как селезенка (4,8%). Однако, в отличие от селезенки, легких CD11c положительные клетки экспрессируют различные количества MHC-II, в том числе различных клеточных популяций, чем CDC. После одноклеточных подготовки, клетка выход общего числа клеток легких был примерно 3,0 до 3,8 х 10 ⁷ клеток / легкого с жизнеспособность 60-70%, из которых немногим более 1% представлены CDC подмножество. Этот процент был увеличен после CD11c магнитная изоляция где общее легких CDC был увеличен примерно на 10 тРедакторы IME (> 16%) от оригинального препарата (рис. 2). Тем не менее, CD11c клеток, экспрессирующих низкие объемы MHC-II (CD11c ^привет / MHC-II ^вот, макрофаги), представленных высоким загрязняющих популяции клеток (> 70%), который был смешан с подмножеством легких CDC. Как показано на рис. 2Б, эти клетки были устранены после шага сортировки клеток, когда чистота CDC достигли> 96%. Обычная выход CDC после всей процедуры составляет 5 х 10 ⁴ клеток / легких. Микрофотографии показывают морфологических характеристик CDC в виде округлых клеток с типичными дендритов (верхняя панель). С другой стороны, CD11c ^привет / MHC-II ^вот представлена ​​морфологически различные подмножества, который показывает сотовой выступы, характерные для макрофагов (М ^, нижний график) ^12.

Рисунок 1. Дифференциальная DC частоты в легких мыши и селезенки. Легкогом ткани селезенки из C57BL / 6 мышей были собраны и обработаны коллагеназы. После коллагеназы пищеварения, клетки окрашивали анти-мышиных CD11c-PE-Cy7 и анти-мышь IA / IE-FITC. Представитель участки проточной цитометрии показывают процент CDC (CD11c ^привет / MHC-II ^{привет)} в легких и селезенке.

Рисунок 2. Выделение CDC легких мыши. Мышь легких суспензии отдельных клеток метили анти-CD11c микрошарики и проходил через автоматический сепаратор клеток.) ​​Представитель график показывает процент CDC (CD11c ^привет / MHC-II ^{привет)} и Макрофаги (М ^, CD11c ^привет / MHC-II ^LO) населения после CD11c обогащения. Дальнейшее окрашивание фракции, обогащенной следуют с использованием анти-мышь CD11c-PE-Cy7 и анти-мышь IA / IE-FITC. Дважды положительные клетки были отсортированы и анализировали с помощью проточной цитометрии. Копределить их морфологии, клетки cytospun и окрашивали изменение Райта-Гимза окрашивания. B) представитель графики показывают проценты CDC и М ^ после сортировки клеток. Микрофотографии показывают представитель изображение легких CDC и легких М ^. Шкала бар = 20 мкм.

Обсуждение

Выделение легочных мыши DC является важным методом для изучения широкого спектра дыхательных стимулов. Процесс получения этих клеток включает в себя важные шаги, которые препятствуют потере клеток, а также жизнеспособности клеток и чистоты. Перфузии легкого до сбора поможет устранить...

Материалы

Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии (необязательно)
ACK буфера лизирующего	Invitrogen	D6-0005DG
Анти-мышь CD11c (HL3)	BD Pharmingen	5580979	PE-Cy7 сопряженных
Анти-мышь IA / IE (269)	BD-Pharmingen	553623	FITC сопряженных
Collangenase типа 1А	Сигма	9891-500мг
Сотовые фильтры	BD Сокол	352340, 352360
CD11c (N418) микрошарики	Miltenyi	130-052-001
Я ДНКазы	Сигма	D5025-150KU
Сбалансированные соли Хэнка решение	Invitrogen	14170
Hepes буферного раствора	Invitrogen	15630
Чашки Петри 60 мм	BD Сокол	351016
GentleMACS ™ C труб	Miltenyi	130-093-237
Нежный диссоциатор MACS	Miltentyi	130-093-235
AutoMACS-Pro ™	Miltenyi	130-092-545
FASCS Aria	BD