Массовое производство генетически модифицированных Aedes aegypti для полевых релизов в Бразилии

Резюме

Для достижения подавления популяции Aedes aegypti с^{помощью системы} RIDL ® (Выпуск насекомых, несущих доминирующий смертельный) необходимо освободить большое количество самцов комаров. Это требует использования методов и технологий массового выращивания для обеспечения надежных систем для получения максимального количества высококачественных самцов комаров.

Аннотация

Изыскиваются новые методы и методы, чтобы попытаться выиграть борьбу с комарами. Последние достижения в области молекулярных методов привели к разработке новых и инновационных методов борьбы с комарами на основе стерильных насекомых Техника (SIT)^1-3. Метод управления, известный как RIDL (Выпуск насекомых, несущих доминирующий^{смертельный) 4}, основан вокруг SIT, но использует генетические методы, чтобы удалить необходимость радиационной^{стерилизации 5-8}. Штамм RIDL Ae. aegypti был успешно протестирован в полевых условиях на Большом Каймане^9,10; дальнейшее использование на местах планируется или продолжается в других странах мира.

Массовое выращивание насекомых было установлено в нескольких видах насекомых и до уровня миллиардов в неделю. Однако у комаров выращивание, как правило, осуществляется в гораздо меньших масштабах, причем наиболее масштабное выращивание осуществляется в 70-х и 80-х годах. Для программы RIDL желательно освободить как можно меньше самок, как они кусаются и передают болезни. В программе массового воспитания есть несколько этапов для производства самцов, которые будут освобождены: производство яиц, выращивание яиц до окукливания, а затем сортировка самцов из самок перед выпуском. Эти мужчины затем используются для программы управления RIDL, выпущенный как куколки или^{взрослых 11,12}.

Для подавления популяции комаров с помощью RIDL необходимо вырастить большое количество высококачественных взрослых^{мужчин 13,14.} Ниже описаны методы массового выращивания OX513A, штамм RIDL Ae. aegypti ⁸, для выпуска и охватывает методы, необходимые для производства яиц и массового воспитания МУЖЧИН RIDL для программы управления.

Введение

Комары передают много патогенных микроорганизмов, которые могут вызвать целый ряд заболеваний у людей и борьбы с этими комарами была продолжающаяся битва на протяжении веков. Стратегии борьбы с насекомыми на основе химических и биологических методов имели некоторые заметные успехи, однако во многих случаях контроль не был устойчивым в долгосрочной перспективе. Например, Бразилия добилась ликвидации Ae. aegypti в 50-х годах, но комар переутомлен за последние 40-50 лет. Это можно объяснить многими причинами, включая устойчивость к инсектицидам, ущерб окружающей среде, плохое^{осуществление программы контроля 15-20,}и быстрое повторное использование без надлежащего мониторинга или реагирования.

Новые методы и методы в настоящее время изыскиваются, чтобы попытаться выиграть эту битву против комаров.  Последние достижения в области молекулярных методов привели к разработке новых и инновационных методов борьбы с комарами на основе стерильных насекомых Техника (SIT)^1-3. Метод управления, известный как RIDL (Выпуск насекомых, несущих доминирующий^{смертельный) 4} основан вокруг SIT, но использует генетические методы, чтобы удалить необходимость радиационной стерилизации. RIDL штаммы были построены для нескольких видов вредителей, включая Ae. aegypti ^5-8, штамм RIDL Ae. aegypti был успешно протестирован в поле на Большом^{Каймане 9,10}; дальнейшее использование на местах планируется или продолжается в других странах мира.  Подавление популяций комаров с помощью RIDL потребует большого количества высококачественных взрослых мужчин, которые^{будут вырастить 3,14}.

Для программы SIT считается желательным выпускать только самцов; самки комаров кусаются и передают болезни. Кроме того, выпущенные стерильные самцы могут быть «отвлечены» освобожденными самками, снижая эффективность программы. Мужской релиз был показан в 3-5 раз более эффективным, чем смешанный секс релиз в больших полевых экспериментов с облученных средиземноморских плодовых^{мушек 21}.

В программе массового воспитания RIDL существует несколько этапов производства самцов для выпуска.  Во-первых, производить яйца, необходимые для выпуска поколения (Рисунок 1). Следующим этапом является выращивание яиц до куколок или взрослых, отделяя личинки от куколок и самцов куколок от самок куколок. Масштабное отделение самцов от самок требует разницы между полами на определенном жизненном этапе, подходящем для массовой сортировки^22. В Ae. aegypti (и других видах комаров) существует значительная разница в размерах между самцами и самками куколок, которые могут быть использованы для методов разделения пола. Отсортированы RIDL мужчин затем освобождены в программе управления, как либо куколки или как^{взрослые 11,12}.

Ниже описаны методы массового воспитания OX513A, штамма RIDL Ae. Aegypti, для освобождения. Описанные методы охватывают методы, необходимые для производства яиц и RIDL мужчин для программы контроля.

протокол

Требования к насекомым

1. Обзор

1. Массовое воспитание имеет несколько этапов, каждая из которых выполняется в отдельной области масс-воспитания блока. На рисунке 1 показана основная фаза воспитания и место их выращивания в объекте массового воспитания.

2. Соображения биобезопасности для насекомых

1. Проект был одобрен комитетом по этике животных университета Сан-Паулу - Бразилия, и все необходимые разрешения и разрешения были получены.
2. Система RIDL использует условную летальность; пищевая добавка (тетрациклин) предотвращает выражение системы RIDL, позволяющей насекомым быть массово воспитаны; без тетрациклина комары умирают. Тетрациклин не находится в местах размножения Ae. aegypti в дикой природе, поэтому любое потомство, произведенное у беглецов, не выживет.  Это добавляет дополнительный уровень безопасности по поводу использования диких насекомых типа (WT), стерилизованных другими методами(т.е. радиацией).
3. Используйте двухдверный вход, знаки "Только для персонала" и экраны насекомых в насекомых. Любые окна должны быть опечатаны, чтобы избежать загрязнения колонии насекомыми WT и помочь предотвратить побеги изнутри насекомых.
4. Местные нормативные акты и органы власти могут предуготовить конкретные дополнительные или альтернативные требования. Свяжитесь с соответствующими органами для получения информации/руководства на ранней стадии и закреплите все необходимые разрешения и разрешения, прежде чем установить штамм RIDL в насекомом.
5. Массовое выращивание насекомых следует использовать только для выращивания RIDL. Никакие другие штаммы или насекомые не должны присутствовать. Это делается для того, чтобы избежать загрязнения штамма RIDL и загрязнения патогенными микроорганизмами, которые могут повлиять на фитнес и выживание, снижая производительность и эффективность освобожденных самцов.

3. Инсектицидный дизайн

1. На рисунке 2 показан план насекомого, используемого в Биофебрике Москамер в Бразилии.
2. Температура во всех помещениях была 26 градусов по Цельсию ± 2) с относительной влажностью около 70-80% и 12:12 часов света: темный цикл с использованием флуоресцентных световых полос.
3. Этот план может быть изменен в соответствии с конкретными требованиями пространства, например, масштаб выпуска будет определять общий размер. Однако производство яиц, выращивание и сортировка, контроль качества (КК) и релизы должны быть разделены на четыре отдельные области: яйцо производства колонии, выпуск поколения, КК, и взрослых хранения для выпуска.
4. Комната колонии производства яиц (приблизительно 20^{м 2}) используется для производства яиц для производства.
5. Зона контроля качества, где эксперименты проводятся для проверки процедур и пригодности линии RIDL, включая измерения скорости люка, количества куколок, размер куколки, и измерения эффективности сортировки и удаления женщин. Тесты также проводятся на загрязнение WT путем проверки на наличие флуоресцентного маркера и фенотипа с использованием офсетных анализов измерения летальности.
6. Комната поколения выпуска (приблизительно 36 m²) требует адекватного космоса для подносов и сортировки личинок и куколок. Лотки содержатся в специально построенных алюминиевых стеллажах. Для выращивания и сортировки требуется большая рабочая зона и раковина, а для мытья подносов и клеток требуется еще одна большая раковина. Ловушка для ловли фильтров была включена в выход сточных вод из раковин, чтобы смягчить побег живых комаров через канализацию.
7. Вся вода, используемая для подносов, удаляется через канализацию, которая имеет отсек, содержащий сетку, которая предотвращает побег насекомых на любом этапе развития.
8. Область необходима для хранения взрослых для выпуска (Взрослый хранения для выпуска, рисунок 2), содержащий стеллажи для хранения устройств выпуска в то время как взрослые созревают до релиза.

Методы производства для массового выращивания RIDL:

Колония производства яиц производит яйца, которые используются в поколении выпуска (рисунок1) для производства взрослых. Есть много общего в двух методах воспитания, но и некоторые различные различия. Процессы воспитания, одинаковые для обеих процедур, описаны только в разделе «Производственная колония яиц».

Колония производства яиц

4. Ларвал производства

Колония производства яиц производит однородные яйца OX513A RIDL⁸ для поколения выпуска. Высокий контроль качества обеспечивает жизнеспособность, пригодность и целостность деформации поставляемых яиц.

1. Стимулом для вылупления является погружение в воду с низким уровнем растворенного кислорода. Чтобы снизить уровень кислорода в воде, нагреть воду до кипения и сразу же поместить 400 мл в 500 мл стеклянных банок (74 мм окружности открытия), надежно закрепить крышку и оставить при комнатной температуре в течение нескольких часов, чтобы остыть.
2. Положите 1 г яиц в банку с кипяченой водой, запечатать и подождать час. Перенесите содержимое в лоток с 2 л воды и оставьте на ночь в условиях насекомых.
3. Поместите вылупившихся личинок в известный объем воды и перемешать с помощью магнитного мешалки и блох в течение достаточного времени, чтобы принять aliquots; энергично или в течение длительного времени повреждает личинки и должен быть сведен к минимуму. Стандартный объем, используемый для люка личинок составляет 1 л, однако плотность более 300 личинок /мл трудно подсчитать и может быть разрушительным. Поэтому не вылупляйте более 300 000 яиц/л воды.
4. Определите скорость люка, взяв три 1 мл aliquots и размещения на листе абсорбляющей бумаги, с сеткой 1 см квадратов, на вершине абсорбющей губки, чтобы впитать излишки воды.  Подсчитайте количество вылупившихся и нехотных яиц с трех квадратов, ищя недостающую крышку вылупившихся яиц. Ожидается, что скорость вылупления составляет около 80-90%.
5. Возьмите четыре алицита по 1 мл каждый и поместите в четыре черных весовых катера (личинки белые и поэтому более легко видны на черном фоне) и подсчитайте количество живых личинок, присутствующих на глаз; рекомендуется использование счетчика. Среднее количество личинок на мл затем используется для расчета объема воды, чтобы добавить на каждом лотке, чтобы получить нужное количество личинок на лоток.
6. Там могут быть большие различия в плотности, при которой личинки могут быть воспитаны между штаммами и видов. Также желательно сравнить размер взрослого самца RIDL с самцами дикого типа; в идеале вы хотите похож на больших размеров RIDL мужчин, которые могут успешно конкурировать с дикими самцами. Поэтому для каждого штамма RIDL необходимо определить идеальную плотность личинок и пойти на компромисс с ограничениями пространства для выращивания и масштабов производства. Плотность колеблется от 0,1-2,5 личинки / мл мы обнаружили, что хорошее сочетание продукции и качества; также обсуждается Медичи²³.
7. Добавить личинки в лотки. На нашем предприятии мы используем лотки размером около 53 см х 37 см х 8 см (L x W x H) и необходимое количество воды для достижения плотности личинок для производства.
8. Добавьте раствор бульона тетрациклина (3 мг/мл в воде) в лотки при разбавлении 1:100, чтобы получить необходимую окончательную концентрацию 30 мкг/мл.
9. Кормите личинок хлопьямирыбной пищи (www.sera.de)ежедневно, которая была измельчена до мелкого порошка. Таблица 1 показывает типичный режим кормления в мг пищи на личинок в день. Кормите личинки до соответствующего дня сортировки в условиях, описанных выше.

5. Сортировка личинок из куколок и самцов/женщин куколок

1. Сортируют личинки из куколок через 8 дней после вылупления, отделяя личинки от куколок. Затем секс-сортировать куколки для мужчин. Устройство, известное как сепаратор^{пластины 24,25} может сортировать личинки из мужских куколок и от женских куколок. Рисунок 3 иллюстрирует использование этого сепаратора пластины для отделения личинок от самцов и самок куколок.
2. Используя мерную ложку с сеткой на дне, откалибровать его с 500 куколок или более и использовать его для настройки клеток и оценить общее количество самцов и самок куколок производства.
3. В первый день сортировки (день 8) большинство куколок являются самцы, так что поместите отсортированы личинки обратно в лоток и обратно до следующего дня, когда большинство куколок являются самками (Рисунок 4).
4. Повторите процесс сортировки каждый день, как описано в шагах 2.1-2.3 до тех пор, пока все личинки не окуклились или до конца рабочей недели.
5. Поместите 1000 самцов куколок (с использованием ложки измерения) в клетку и на 9-й день добавьте 3000 женских куколок в ту же клетку (мы используем 30 см высотой и 30 см в диаметре ПВХ труб, адаптированных с сетчатым верхом и сетчатым отверстием доступа, но 30 см х 30 см х 30 см пластиковых клеток также доступны из BugDorm).
6. Разрешить взрослым спариваться в течение по крайней мере 2 дней и предоставить им раствор сахарозы (10%) на мокром хлопке ad libitum перед кормлением крови. Собирайте яйца в течение двух недель (два гонотрофических цикла) с двумя каналами крови в неделю. Это дает в среднем 143000 яиц из клетки 3000 женщин (в среднем 48 яиц / женщины). Для производства 4 миллионов яиц в неделю необходимо устанавливать около 28 клеток каждую неделю.

6. Кормление крови

1. Алюминиевая пластина кормления система поставляет клетки с кровью два раза в неделю. Карман крови создается на стороне алюминиевой пластины (10 см х 10 см х 3 мм) с Parafilm(рисунок 5). Для поощрения кормления, кровь нагревается путем размещения подогревом мешок фасоли на верхней части тарелки подачи. Мешок фасоли состоял примерно из 250 г пшеничных зерен в тканевом мешке, который нагревается около 10 сек в микроволновой печи. Кровь, которую мы используем для кормления, от местной скотобойни; как эти животные (в основном козы и овцы) для потребления человеком они проверяются, чтобы избежать присутствия патогенных микроорганизмов.
2. Через три дня после кормления крови, место oviposition для женщин, чтобы отложить яйца предоставляется. Место oviposition круглый пластичный контейнер заполненный до около 1/4 с водой и бумагой фильтра покрывая внутренность. Через два дня сайт oviposition удаляется. Для максимального производства яиц убедитесь, что фильтровальную бумагу покрывает всю доступную поверхность внутри контейнера и остается влажной.
3. Удалите яичную бумагу и поместите на абсорбционную бумагу, чтобы высохнуть в условиях насекомых; яйца требуют периода кондиционирования при высокой влажности (более 70%) по крайней мере 48 часов после того, как положил. Яйца могут быть оставлены в насекомое на срок до 3 месяцев с минимальным снижением скорости люка, до тех пор, как влажность держится^{высокой 25}.
4. Колония производства яиц должна быть достаточного размера, чтобы обеспечить количество яиц, необходимых на еженедельной основе для выпуска программы. Объект, описанный выше, может производить около 4 миллионов яиц с 28 клетками, установленными еженедельно. Рекомендуется хранить достаточное количество яиц, чтобы гарантировать по крайней мере 4 недели яиц для выпуска поколения и производства яиц колонии.

Поколение релизов

7. Ларвал Продукция

Процессы вылупления, выращивания и сортировки для генерации высвобождаются идентичны ранее описанной методике колонии производства яиц. Тем не менее, масштабы производства гораздо больше, и это требует больше лотков и больше усилий.

8. Сортировка личинок, самцов куколок и женских куколок

1. Сортировка личинок, самцов куколок и женских куколок идентична методу, описанного для производства яиц.
2. После сортировки самцов куколок важно проверить женское загрязнение перед выпуском; не должно быть более 1% женщин, присутствующих. Возьмите три алициты из 500 куколок (три случайных куколки измерения ложки) и подсчитать количество женщин куколки настоящее время. Самки могут быть определены, поскольку они, как правило, больше, чем мужчины и от различий в формеполовых долей (рисунок 6)²⁷. Если женщин больше 1%, к ней следует прибегнуть и проверить еще раз.
3. Используйте только мужчин с 8-го и 9-го дня для освобождения; автоклав любых оставшихся личинок и куколок. В Бразилии к этим отходам следует относиться так же, как и к медицинским отходам, однако в других странах правила могут отличаться. Не используйте женские куколки и личинки из поколения выпуска для колонии производства яиц из-за различий в контроле качества, воспитании и загрязнении рисков от больших чисел, а также более низкий контроль качества.

Взрослый хранения для выпуска: Поместите мужчин в релиз устройств выйти и созреть до выпуска. Подробная информация об устройствах выпуска не охватывается этим методом. Однако емкость устройств выпуска, которые мы используем, составляет около 1000 мужчин. Детали метода выпуска (устройство выпуска и система выпуска) не охвачены этим методом.

Результаты

Ожидаемые результаты окукливания для производства показаны на рисунке 4. Самцы окукливаются первыми, достигнув пика на 8-й день, а самки вынашливаются на 9-й день после вылупления. Важно измерить эту кривую выкащения, чтобы знать лучшее время для сортировки самцов с самок.

Результаты более чем 6 месяцев сортировки мужских и женских куколок показывают, что женское загрязнение в среднем составляет 0,02%(рисунок 5; SEM - 0,004%). Этот показатель загрязнения представляет собой лишь 400 женщин, выпущенных в течение одного месяца выбросов (около двух миллионов самцов). Текущее производство яиц в неделю составляет 4 миллиона. Из них 3,5 миллиона вылупились для яичной колонии и производства, а остальная часть хранится для резервного копирования. Приблизительно 11% яиц используются для производства яиц колонии и остальные для производства релиз. Уровень вылупления яиц в среднем составляет 87,3% (SEM 0,5%) и урожайность самцов куколок из личинок L1 в среднем составляет 29,5% (SEM 1,2). Два миллиона личинок производятся каждую неделю для колонии поколения выпуска, производящей около 571 000 самцов куколок (SEM 14 000). Pupae и взрослой смертности во время появления и выпуска в среднем 5%, в результате чего примерно 543000 (SEM 13000) выпустили взрослых самцов комаров в неделю. Ожидается, что текущее производство 4 миллионов яиц в неделю может быть сокращено до 3 миллионов евро в неделю с дальнейшей оптимизацией для сокращения потерь от потерь и хранения. В общей сложности для описываемого производства требуется 6 сотрудников; четыре работают над выпуском поколения, а остальные два на яичной колонии.

контроль качества

Контроль качества имеет важное значение для поддержания качества взрослых, эффективности воспитания, труда и затрат.

Контроль фенотипа Трансгена

Для проверки экспрессии гена RIDL выполняются два контроля, во-первых, чтобы проверить экспрессию маркера флуоресценции, а во-вторых, проверить экспрессию признака летальности RIDL при отсутствии тетрациклина. Все личинки должны выражать флуоресцентный маркер. Чтобы проверить, если флуоресцентный маркер выражается, как ожидалось, 2000 первых личинок instar проверяются под стереомикроскопом Leica M'DLIII с фильтром DsRed2 (Texas Red), чтобы определить, присутствуют ли какие-либо нефлюоресцентные лица. Без тетрациклина ген RIDL выражается, и мы ожидаем 3-4% выживаемости для взрослых⁸. Чтобы проверить это, дополнительный лоток настроен для каждой партии выпуска без тетрациклина. Единственное отличие от нормального воспитания является пища уменьшается на 2/3 с 6-го дня, потому что накопление избыточной пищи из-за мертвых личинок может привести к избыточному росту бактерий.

Воспитание управления

Четыре лотка из поколения релиза случайным образом выбраны для сортировки и подсчета отдельно. Количество самцов и самок куколок регистрируется с каждого лотка каждый день(рисунок 4). Любое отклонение от ожидаемого числа мужчин и женщин указывает на потенциальную проблему, которая может повлиять на производство и / или фитнес и может быть по сравнению с яйцом колонии, чтобы помочь определить источник проблем.

Измерения куколок

Pupae размер было показано, что коррелирует с размером^{взрослого 28}. В качестве контроля качества для взрослого размера ширина цефалоторакса измеряется по крайней мере 30 мужских куколок для каждого дня сортировки от поколения выпуска; для яичной производственной колонии также измеряются женские куколки. Средняя ширина цефалоторакса составила 1,05 мм (SEM 0,005) для освобожденных самцов и 1,04 мм (SEM 0,006) и 1,29 мм (SEM 0,006) для мужчин и женщин соответственно производство яиц, колония; аналогичные результаты были получены для Ae. albopictus массы^{воспитания 24}.

Рисунок 1. Этапы массового выращивания комаров для использования в программе RIDL/SIT. Колония производства яиц имеет высокий уровень контроля качества для обеспечения качества яиц, поставляемых для выпуска продукции.  Яйца разготовливаются до куколок в колонии освобождения, где самцы сортируются с самками.  Взрослые мужчины затем используются для программы управления RIDL.

Рисунок 2. Схема выращивания для производства МУЖЧИН RIDL для выпуска программы. Яйца высокого качества постоянно производятся в комнате колонии производства яиц, а затем доливаются до куколок в комнате поколения выпуска. Личинки и куколки затем разделены и куколки секс-отсортированы для мужчин. Мужчины затем помещаются в устройства выпуска и позволили созреть для взрослых для освобождения в комнате хранения и освобождения взрослых. 

Рисунок 3. Разделение личинок, самцов куколок и самок куколок с помощью сепаратора^{пластины 26}.  Сепаратор пластины использует разницу в размерах между личинками, самцами куколок и самками куколок для сортировки этих трех различных стадий жизни; личинки, как правило, меньше, чем самцы куколок, которые, в свою очередь, меньше, чем женские куколки.  Инструмент состоит из двух стеклянных пластин; один крепится к наклонной металлической раме, а другой сидит на верхней части первой пластины и может быть перемещен по отношению к первому с помощью четырех винтов регулировки (A).  Четыре регулировки винты позволяют внешней пластины, которые будут установлены под углом к задней пластине, чтобы клин формы пространства формируется между пластинами, сужается вниз.  Личинки и куколки заливают между стеклянными пластинами(B)и аккуратно промывают с помощью водяного шланга(C).  При регулировке угла пластины, личинки, мужские куколки и женские куколки могут быть разделены (D).  С непрерывным промывки и увеличения угла пластины личинки могут быть промыты через первый (в сито), а затем самцы куколок и, наконец, самки куколок. 

Рисунок 4. Кривые выкапывания для массы вырастили RIDL Ae. aegypti.  На этом графике показан средний процент выкащения для массы подоруженых куколок RIDL мужчин и женщин в течение 23 недель наблюдения с 135 000 куколок, восстановленных в неделю.  Бары ошибок - стандартная погрешность среднего, n No 23. На первой коллекции (день 8) мы восстановили в среднем 59% мужчин и 30% самок куколок из общего куколки оправился от лотков в течение 5 дней. 

Рисунок 5. Среднее женское заражение отсортированного самца куколки. На этом графике показан среднемесячный процент женского загрязнения во время мужской сортировки на 8-й день после вылупления в течение шести месяцев. 

Рисунок 6. Алюминиевая пластина системы подачи крови. Пластина(B) покрыта Parafilm ( A )икровь pipetted в карман, а затем запечатаны (D). Пластина помещается на клетку и нагревается, поместив разогретый мешокфасоли ( C) на вершине (E). 

Рисунок 7. Отличительные мужчины и женщины Ae. aegypti куколки. Ae. aegypti куколки могут быть надежно секс различия в форме генитальной доли (в конце пупок брюшной сегментов чуть ниже весла). Кроме того, мужчины также, как правило, меньше, чем женщины.   

Таблица 1. Общий режим кормления личинок Ae. aegypti RIDL (мг пищи на личинку в день). Для расчета фактического количества пищи требуется умножить на общее количество личинок на лоток.

Обсуждение

RIDL является эффективным и экологически безопасным методом борьбы с комарами^3,29-31. Техника применима к комплексной программе борьбы с вредителями, и большинство современных методов борьбы, включая ларвициды, сокращение мест размножения и взрослые убийства, совместимы с этой технологией. Этот метод описывает, как производить до 570000 RIDL мужских куколок в неделю для использования в контроле Ae. Aegypti и, как нам известно, это первое описание производства трансгенных комаров такого масштаба. Некоторые сопоставимые производственные системы были разработаны для дикого типа Ae. aegypti в 1960-х и 70-х^{годов 25}, однако не было сопоставимого производства в этом масштабе с тех пор. В Бразилии около 11 миллионов мужчин были освобождены с февраля 2011 года по февраль 2012 года. Численность мужчин, необходимых для того, чтобы контролировать данный район, зависит от ряда факторов, включая численность дикой популяции, рассредотывание освобожденных самцов, выживаемость и конкурентоспособность мужчин после освобождения, а также экологические условия.  Предыдущие исследования показали, что RIDL может уменьшить популяцию комаров, по крайней мере 80%⁹.

Необходим баланс между оптимизацией массового выращивания для масштаба производства и себестоимости по сравнению с качеством мужчин. Например, увеличение плотности личинок может увеличить производственные мощности за счет сокращения требуемого пространства, рабочей силы и времени до^{окукления 32.} Однако слишком высокая плотность личинок может привести к более мелким и более коротким обжитым самцам с уменьшенной^{способностью спаривания 32,33.} Качество мужчин по отношению к программе SIT в конечном счете будет оцениваться по способности освобожденных самцов спариваться с самками на местах. Обширная оценка на местах требуется для оценки конкурентоспособности спаривания по сравнению с дикими^{аналогами 9,10}. Это часто делает непрактично оценивать, какие именно факторы делают "высокого качества" мужского комара. Однако поддержание последовательного производства и качества (в той мере, в какой это можно регулярно оценивать) в крупномасштабном массовом выращивании имеет первостепенное значение. Это требует высокого уровня бдительности и стандартизации всего процесса с небольшими колебаниями, потенциально оказывает значительное воздействие. Алицитирование личинок L1 является критическим шагом и иллюстрирует этот момент. Aliquoting правильное количество личинок в лотки имеет важное значение для хорошего качества производства. Режим кормления точно приспособлен для определенного количества личинок. Слишком мало/много личинок приведет к чрезмерной/под кормление, что влияет на выживаемость личинок, размер куколок и время для окукливания. Если есть секрет искусства массового воспитания, то это обеспечение того, чтобы многие небольшие шаги в производственном цикле проводились последовательно, точно и с высоким уровнем контроля качества, как описано в настоящем документе.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vipan Premium	Sera GmbH	190	http://www.sera.de/uk/pages/products/product/sera-vipan-3.html
Tetracycline	Sigma Aldrich	T7660	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?D7=0&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&N4=T7660|SIGMA&N25=0&QS=ON&F=SPEC
Plate separator	J.W. Hock	5412	http://www.johnwhock.com/download/manuals/instr_5412_separator.pdf
Parafilm M	Pechiney Plastic packing	PM-996	www.parafilm.com
Rearing pans for Release generation (53 cm x 38 cm x 8 cm)	Pleion	0757	http://pleion.actcenter.com.br/produtos.asp?opcao=1
Fluorescent scope	Leica Microsystems	MZ FLIII	http://www.leica-microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica%20MZ%20FLIII/Brochures/M1-160-0de.pdf
Adult cages	BugDorm	DP1000	http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html
Filter paper	CELAB		http://www.casadolaboratorio.com.br/subpage118.html