Построение коллагена Гидрогель для доставки стволовых клеток, загруженных Хитозан микросфер

Резюме

Главным препятствием в текущем лечения стволовыми клетками заключается в определении наиболее эффективных методов для достижения этих клеток в ткани хозяина. Здесь мы описываем на основе хитозана способ доставки, что является эффективным и простым в подходах, позволяя при этом жировых стволовых клеток для поддержания их multipotency.

Аннотация

Мультипотентных стволовых клеток было показано, что чрезвычайно полезно в области регенеративной медицины ^1-3. Тем не менее, для того, чтобы использовать эти клетки эффективно для регенерации тканей, число переменных должны быть приняты во внимание. Эти переменные включают в себя: общий объем и площадь поверхности имплантации сайта, механические свойства ткани и ткани микросреда, которая включает в себя сумму васкуляризации и компоненты внеклеточного матрикса. Таким образом, материалов, которые используются, чтобы предоставить эти клетки должны быть биологически совместимыми с определенным химическим составом при сохранении механической прочности, который имитирует ткани хозяина. Эти материалы также должны быть проницаемы для кислорода и питательных веществ для обеспечения благоприятной микросреды для клеток приложить и размножаться. Хитозан, катионный полисахарид с отличной биосовместимости, может быть легко химически модифицированных и обладает высоким сродством связываться с Mac в естественных условияхromolecules ^4-5. Хитозан имитирует гликозаминогликана часть внеклеточного матрикса, что позволяет ему функционировать в качестве субстрата для клеточной адгезии, миграции и пролиферации. В этом исследовании мы используем хитозана в виде микросфер для доставки жировых производных стволовых клеток (АОК) в коллагена основаны трехмерных леса ^6. Идеальная клетка-микросфер соотношение определяется по времени инкубации и плотности клеток для достижения максимального числа клеток, которые могут быть загружены. Как только ASC высевают на микросферы хитозана (CSM), они встроены в коллаген леса и может сохраняться в культуре в течение длительного периода времени. Таким образом, данное исследование представляет собой метод точно доставить стволовые клетки в трехмерном биоматериала эшафот.

протокол

1. Изоляция жировой производные стволовые клетки (ASC)

Примечание: Все процедуры были выполнены при комнатной температуре, если не указано иное.

1. Изолировать крысы паранефральная и придатка жировой и промыть буферной соли стерильной Хэнка решение (HBSS), содержащей 1% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), как описано выше ^6.
2. Фарш ткани и передавать 1-2 г на 25 мл HBSS, содержащим 1% FBS в 50 мл трубку и центрифуги в 500 г в течение 8 минут при комнатной температуре.
3. Соберите свободно плавающего слоя жировой ткани и передачи до 125 мл колбу Эрленмейера и лечение с 25 мл коллагеназы тип II (200 ЕД / мл) в HBSS в течение 45 мин при 37 ° С на орбитальном шейкере (125 оборотов в минуту).
4. Осторожно снимите жидкой фракции (ниже масла и жировой слой) и фильтровать последовательно через 100 мкм и 70 мкм сетчатый фильтр из нейлона. Центрифуга фильтрата на 500 г в течение 10 мин при комнатной температуре, аспирации supernatanт и промыть осадок дважды с 25 мл HBSS.
5. Ресуспендируют клеточный осадок в 50 мл среды роста (MesenPRO RS базальной среды) с добавлением MesenPRO RS роста дополнения, противогрибковых антибиотиков (100 ЕД / мл пенициллина G, 100 мкг / мл стрептомицина сульфат и 0,25 мкг / мл амфотерицина B) и 2 мМ L-глутамина и пипетки клетки на 2 колбы T75 (25 мл / колбы).
6. Культура ASC в 5% CO ₂ увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° C (проезд 2-4 ASC используются для всех опытов).

2. Подготовка Хитозан микросфер (CSM)

Примечание: Все процедуры были выполнены при комнатной температуре, если не указано иное.

1. CSM готовятся воды в нефти эмульгирование процесс наряду с ионной техники коацервации используя наш предыдущий протокол ^6. Эмульсию водный раствор хитозана (6 мл 3% вес / объем хитозана в 0,5 М уксусной кислоты) в 100 мл смеси масляную фазу, состоящую из соевыхмасла, октаноле (1:2 об / об) и 5% сорбита-моноолеат (диапазон 80) эмульгатор, с помощью накладных расходов (1700 оборотов в минуту) и магнитной мешалкой (1000 оборотов в минуту) одновременно в противоположных направлениях. Этот двойной метод смешивания гарантирует, что мицеллы образуются на ранних стадиях до сшивания происходит, может оставаться в растворе и не оседают на дно. Кроме того, магнитная мешалка средств в де-объединения хитозана в мицеллообразования и rigidization.
2. Смесь непрерывно перемешивают в течение примерно 1 часа до стабильных водно-нефтяной эмульсии получается. Ионные сшивания начинается с добавлением 1,5 мл 1% вес / объем гидроксида калия в октаноле каждые 15 мин в течение 4 ч (24 мл общего объема).
3. После завершения реакции сшивания, медленно перелить масло фазы смеси, содержащей CSM и сразу же добавлять сферы до 100 мл ацетона. Вымойте сферы с ацетоном до масляной фазы полностью удаляется.
4. Высушите восстановленные сферы в эксикаторе вакуум и анальныйyze без дальнейшей обработки. Средний размер частиц CSM, площадь поверхности на миллиграмм и устройство кубический объем определяли с помощью анализатора размера частиц.
5. В последующих экспериментах, мыть CSM три раза стерильной водой для удаления остатков солей и стерилизуют при абсолютном спирте.

3. Определение количества свободных аминогрупп в CSM

Примечание: Все процедуры были выполнены при комнатной температуре, если не указано иное.

1. Определить количество свободных аминокислот групп, присутствующих в CSM после ионной сшивание с помощью тринитро бензолсульфоновая (TNBS) кислоты из анализа Bubins и Ofner ^7. Инкубировать 5 мг микросфер с 1 мл 0,5% раствора TNBS в 50 мл стеклянной трубки в течение 4 ч при 40 ° С и гидролиза с добавлением 3 мл 6N HCl при 60 ° С в течение 2ч.
2. Охладите образцы до комнатной температуры, и извлекать свободную TNBS добавлением 5 мл дистиллированной воды и 10 мл этиловогоэфира.
3. Теплый 5 мл аликвоты водной фазы до 40 ° С на водяной бане в течение 15 минут для испарения остаточной эфир, охладить до комнатной температуры и разбавляют 15 мл воды.
4. Измерьте оптическую плотность при 345 нм с помощью спектрофотометра использованием TNBS решение без хитозана как пустые и хитозана для CSM подготовка для определения общего количества аминогрупп. Оцените количество свободных аминогрупп CSM относительно хитозана.

4. Загрузка ASC в CSM

Примечание: Все процедуры были выполнены при комнатной температуре, если не указано иное.

1. Уравновешивать 5 мг стерилизовать CSM из раздела 2.5 в стерильной HBSS в ночное время и добавить в 8 мкм, размер пор мембраны культуры пластины вставки (24-луночного планшета).
2. После CSM поселились на мембране, тщательно аспирации HBSS и добавить 300 мкл питательной среды для внутренней вставкой и 700 мкл питательной среды для гоэлектронной вне вставки.
3. Ресуспендируйте ASC в соответствующей концентрации (1 х 10 ⁴ до ⁴ х 10 ⁴⁾ в 200 мкл среднего роста и семян на МКС внутри вставки пластины культуры. Окончательный объем среды в культуре вставки, после посева, составляет 500 мкл.
4. Инкубируйте ASC семенами на МКС в течение 24 ч в 5% CO ₂ увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° C.

5. Определение Процент ASC Загрузка и жизнеспособность клеток в CSM

Примечание: Все процедуры были выполнены при комнатной температуре, если не указано иное.

1. После инкубации собирают ASC-загруженным CSM в стерильном 1,5 мл микроцентрифужных трубы, не нарушая клетки, которые мигрировали в вставкой мембраны.
2. Удаление остаточных средних и добавить 250 мкл свежей среды, рост к трубе.
3. В каждую пробирку добавляют 25 мкл МТТ [3 - (4,5-dimethylthiozole-2-ил) -2,5-diphenyltetrazolium метила]Решение (5 мг / мл) и инкубировать в течение 4 ч в 5% CO ₂ увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° C.
4. После инкубации удалить среды, добавить 250 мкл диметилсульфоксида, и вихрь смесь в течение 2-5 мин для растворения формазана комплекса.
5. Центрифуга CSM при 2700 х г в течение 5 минут, и определить, супернатант поглощения измеряется при 570 нм с использованием 630 нм в качестве ссылки.
6. Определить количество клеток связано с CSM по отношению к поглощению значением, полученным от известных количества жизнеспособных ASC.

6. Характеризуя ASC-CSM-Embedded Коллаген гель

Примечание: Все процедуры были выполнены при комнатной температуре, если не указано иное.

1. Mix ASC-загруженным CSM (5 мг содержащих ≈ 2 × 10 ⁴ клеток) с коллагена 1 типа (7,5 мг / мл), выделенных из сухожилий хвоста крысы по методу Борнштейн ⁸ и фибриллировать после корректировки рН до 6,8 с помощью 2 н.
2. Добавить фибриллированная коллагена ASC-CSM смесь на 12-луночного планшета и инкубировать 30 минут при температуре в 5% CO ₂ увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° C.
3. После полного аритмия, инкубировать коллагена ASC-CSM гели на срок до 14 дней в 5% CO ₂ увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° C.
4. Выпуск и миграции клеток из CSM в геле наблюдаются с использованием стандартных методов микроскопии.

7. Представитель Результаты

В настоящем исследовании мы разработали стратегию в пробирке для доставки стволовых клеток из хитозана микросфер (CSM) в коллагеновый гель эшафот. Пористые CSM одинакового размера (175-225 мкм в диаметре) и состава были подготовлены и использовались как мобильные носители (рис. 2). После инкубации с ASC CSM, клетки приводятся в концентрации 2 х 10 ⁴ cells/5mg из CSM. Клетки были способны к распространению в микросферы, в то время как расширение филоподиив пористую расщелинах микросферы (рис. 3). Как только клетка загруженных CSM были смешаны с коллагеновый гель, клетки сразу же начали мигрировать в гель (рис. 4).

Таблица 1. Биологические преимущества использования хитозана и коллагена в систему доставки стволовых клеток.

Рисунок 1. Схема изображающая общую стратегию двойного использования ASC-CSM леса загруженных коллагена. На рисунках 2, 3 и 4, аннотированные в схему для интерпретации образов.

Рисунок 2. Схематическое изображение изображающие процесс посева стволовых клеток на хитозана микросферы. ПроцессESS включает в себя совместное культивирование с ASC CSM в 8 - мкм размер пор мембраны культуры пластины вставки. После 24 часов, микросферы удаляются из вставки и готовы для внедрения в матрицу биоматериала.

Рисунок 3. Морфологические характеристики CSM загружены с ASC. Группа изображает свет микрофотография ASC-загруженным CSM, в то время как панель B показывает те же поля зрения с наложенными на изображение, полученное с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии. ASC был с предустановленной кальцеин AM (зеленый). Группа C изображает образ изображения SEM без нагрузки микросфер, а панель D показывает клетки загружены на микросфер (звездочки). ПЭМ-изображение в электронной панели показывает сечение патронов микросфер. Множество пор и трещин, расположенных на территории микросфер. Группа F показывает поперечного сечения микросферы с клетками (стрелки), который прилагается и расширение филоподии в создапороков. Оригинальный увеличениях: и B = 70X, C = 500x, D = 2000 х, E и F = 2500 х.

Рисунок 4. Миграция из ASC CSM в трехмерном коллагена эшафот. Панели А и В изображают КСМ с клетки мигрируют от микросфер и в коллагеновой матрице на 3 день (A, стрелки). Группа B показывает аналогичную культуру через 12 дней. Просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) изображения представлены на C, D и E. Звездочки в C и D показывают, микросферы, которые были поперечного сечения с клетки мигрируют от микросфер (стрелки). Высшее увеличение панели D изображен на панель E и показывает клетку филоподии прикреплены к коллагена (вставка). Оригинальный увеличение: и B = 100x, C и D = 6000 х, E = 20000 х, вставка = 150000 х.

Рисунок 5.Схема изображающий огромного использования CSM в регенеративной медицине и доставки лекарств.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Главным препятствием в стволовой клеточной терапии разрабатывает эффективные методы для доставки клеток к указанной области для ремонта. В связи с пациента к пациенту изменчивости, тип ткани, размер повреждений и глубины; методика доставки стволовых клеток должны определяться в кажд...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента / оборудование	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
Хэнкс BalancedSalt Решение (HBSS)	Гибко	14175	Потребляемый
Эмбриональной телячьей сыворотки	Hyclone	SH30071.03	Потребляемый
Коллагеназы II типа	Sigma-Aldrich	C6685	Потребляемый
70-мкм нейлоновая сетка фильтра	BD Biosciences	352350	Потребляемый
100 мкм нейлоновая сетка фильтра	BD Biosciences	352360	Потребляемый
MesenPRO рост средней система	Invitrogen	12746-012	Потребляемый
L-глютамин	Гибко	25030	Потребляемый
T75 тканевой культуры колбу	BD Biosciences	137787	Потребляемый
Хитозан	Sigma-Aldrich	448869	Потребляемый
Уксусная кислота	Sigma-Aldrich	320099	Потребляемый
Октаноле	Acros Organics	150630025	Потребляемый
Сорбитан-моноолеат	Sigma-Aldrich	S6760	Потребляемый
Гидроксид калия	Sigma-Aldrich	P1767	Потребляемый
Ацетон	Fisher Scientific	L-4859	Потребляемый
Этанол	Sigma-Aldrich	270741	Потребляемый
Тринитро бензолсульфокислота	Sigma-Aldrich	P2297	Потребляемый
Соляная кислота	Sigma-Aldrich	320331	Потребляемый
Этиловый эфир	Sigma-Aldrich	472-484	Потребляемый
8 мкм ткани Вставки культуры плиты	BD Biosciences	353097	Потребляемый
1,5 мл Трубы Микроцентрифуга	Рыбак	05-408-129	Потребляемый
МТТ реагентов	Invitrogen	M6494	Потребляемый
Диметилсульфоксида	Sigma-Aldrich	D8779	Потребляемый
Qtracker мечения клеток Kit (Q трекер 655)	Молекулярные зонды	Q2502PMP	Потребляемый
Коллаген типа 1	Travigen	3447-020-01	Потребляемый
Едкий натр	Sigma-Aldrich	S8045	Потребляемый
12-луночных тканевой культуры	BD Biosciences	353043	Потребляемый
Центрифугировать	Эппендорф	5417R	Оборудование
Орбитальный Шейкер	Нью-Брансуик Scienctific	C24	Оборудование
Увлажненном инкубаторе с воздушным 5% CO 2	Thermo Scientific	Модель 370	Оборудование
Накладные мешалки	IKA	Visc6000	Оборудование
Магнитная мешалка	Гранулирование	PC-210	Оборудование
Вакуум-эксикатор	-	-	Оборудование
Анализатор размеров частиц	Малверн	STP2000 Spraytec	Оборудование
Водяная баня	Fisher Scientific	Isotemp210	Оборудование
Спектрофотометр	Beckman	Beckman Coulter DU800UV/Visible спектрофотометр	Оборудование
Вихревой	Diagger	3030a	Оборудование
Считыватель микропланшетов	Molecular Devices	SpectraMax M2	Оборудование
Свет / флуоресцентный микроскоп	Олимп	IX71	Оборудование
Конфокальной микроскопии	Олимп	FV-500 лазерный сканирующий конфокальный микроскоп	Оборудование
Сканирующий электронный микроскоп	Carl Zeiss микрофонаroImaging	Лев 435 VP	Оборудование
Просвечивающего электронного микроскопа	JEOL	JEOL 1230	Оборудование