Индукционная трансплантат против хозяина и<em&gt; В Vivo</em&gt; Т-клеток Мониторинг Использование MHC соответствием мышиной модели

Резюме

Мышиные трансплантации костного мозга является широко используемым методом для изучения иммунологических механизмов, регулирующих трансплантат против хозяина заболевания у людей. Возможность мониторинга T моделей торговли клетки В естественных условиях Позволяет для детального анализа развития и увековечения Т-клеточные реакции во время трансплантат против хозяина.

Аннотация

Трансплантат против хозяина (РТПХ) является ограничивающим барьером для широкого использования трансплантации костного мозга в качестве лечебной терапии для различных гематологических недостатков. GVHD вызвано аллореактивных зрелых Т-клеток, присутствующих в трансплантат костного мозга, которые переплетаются в получателе и привести к повреждению принимающих органов. Тем не менее, у мышей, Т-клетки должны быть добавлены к посевной костного мозга, чтобы вызвать РТПХ. Хотя большая работа была проделана для характеристики Т-клеточного ответа после трансплантации, биолюминесцентные технологий визуализации является неинвазивным методом контроля T модели ячейки торговли в естественных условиях.

После смертельного облучения, получатель мышам трансплантировали клетки костного мозга и селезенки мышей-доноров. Т-клеток подмножества из L2G85.B6 (трансгенных мышей, которые конструктивно выражать люциферазы) включены в пересадке. По пересадке только определенные подмножества T клетки, один в состоянии отслеживать специфические Т-клетки подмножеств в естественных условиях,и на основе их местоположения, разработка гипотез о роли специфических Т подмножеств ячейки в развитии РТПХ в различные моменты времени. На заданный после пересадки интервалы, получатель мышей загружаются использованием Xenogen ИВИС CCD камера. Интенсивность света может быть определена количественно с помощью программного обеспечения живой образ, чтобы создать псевдо-цветное изображение на основе фотонов света (красный = высокая интенсивность, фиолетовый = низкая интенсивность).

Между 4-7 дней после пересадки, получатель мышей начинают проявляться клинические признаки РТПХ. Кук и др. ^1. Разработана система баллов для количественной оценки прогрессирования заболевания на основе меха получателя мышей текстуры, целостность кожи, активность, потеря веса, и осанка. Мыши, забитых в день, и эвтаназии, когда они становятся умирающей. Мыши-реципиенты обычно становятся умирающей 20-30 дней после пересадки.

Мышиной модели являются ценными инструментами для изучения иммунологии РТПХ. Выборочно пересадка частности Т-клеток подмножества др.минимумы тщательное определение роли каждого подмножества играет. Неинвазивного отслеживания Т-клеточные реакции в естественных добавляет еще один слой ценность для мышиных моделях РТПХ.

протокол

1. Летального облучения

1. Разместить до 10 мышей получателя в microisolator клетки совместимы с облучателем, которые будут использоваться.
2. Облучения в 2 равные дозы подведения суммарной дозы (суммарная доза = 9 сГр для получателей BALB.B). Второй облучения должна быть 3 часа после первого. Инъекции должны происходить между 4-6 ч после окончательного облучения. Облучения мышей в любом Cs ¹³⁷ источников или RS2, 000, облучатель.
3. После второй дозы облучения мышей в магазине microisolator клетку с подкисленной водой до момента пересадки.

2. Подготовка спленоцитов

1. Усыпить одного донора мыши в соответствии с ведомственным руководящим принципам. Каждый донор обычно дает 75x10 ⁶ - 125x10 ⁶ спленоцитов. Использование CD8 комплекты очистки, каждая мышь обычно дает 6x10 ⁶ - 12x10 ⁶ CD8 Т-клеток.
2. Удалить селезенки, сначала делает вертикальный разрез 2 см на 2 см вправо от средней линии непосредственнопод грудной клеткой. Разрезать меха, кожи и висцеральных мембраны.
3. Удалить селезенки и создать единый суспензии клеток селезенки, создав в 40 мкл сито в чашку Петри с 1640 RPMI с 5% FBS. Используйте поршень шприца, чтобы разбить селезенку, пока весь селезенка была пропускают через сито.
4. Повторите этот процесс для каждого WT и L2G85.B6 донора. Соберите все WT одного клеточные суспензии в 1-50 мл коническую трубку, и собрать все L2G85.B6 одного клеточные суспензии в отдельную 50 мл коническую трубку.
5. Центрифуга клетки при 1200 оборотов в минуту в течение 10 мин при 4 ° C. Ресуспендируют окатышей в 1640 году RPMI с 5% FBS и подсчет клеток.

3. Подготовка костного мозга

1. Удалите кожу от одной задней конечности донора мыши.
2. Аккуратно срезаем столько мышечной ткани как можно дальше от бедра и голени / малоберцовой кости.
3. Удалить задних конечностей, сокращая расстояние бедренной кости в тазобедренном суставе. Срежьте задние лапы чуть ниже голени / малоберцовой кости пересечения. Все кости сокращения должны быть сделаны с помощью надежное ножницы.
4. Осторожно удалите оставшиеся мышечной ткани. Отрежьте малоберцовой кости, относительно небольшой костный мозг находится в малоберцовой кости и не стоит усилий.
5. Поместите заднюю конечность в холодную 1640 RPMI 5% FBS процесса и повторите со второй задней конечности. Каждая мышь должна принести между 20x10 ⁶ - 40x10 ⁶ клеток костного мозга.

4. Удаление костного мозга

1. Удалите одну из задних конечностей средств массовой информации и поместить в большую чашку Петри с небольшим количеством холодной среды (~ 1 мл).
2. Срежьте коленного сустава. Использование шприцев (объем> 5 мл), вставки подкожной иглой в голень и нажмите шприца, пока все красные материал удаляется из салона голени. Повторите процесс с бедренной костью. Удалите оставшиеся кости лишенной костного мозга. Повторите процесс со второй задней конечности.
3. Создать суспензии отдельных клеток с помощью пипетки средах, содержащих костного мозга в большое блюдо Петри и использовании поршень шприца и 40 мклмеш. Внесите одной клеточной суспензии в 50 мл коническую трубку и держать на льду.

5. CD3 истощения

Есть множество способов, чтобы исчерпать CD3 + клеток из костного мозга. Наша лаборатория использует набор сделанных Miltenyi Biotec (CD3-биотин - 130-093-021). Разрушающим CD3 + клеток из костного мозга следуя протоколу производителя. Буфер для комплектов Miltenyi в дальнейшем будем называть MACS буфера (2 мМ ЭДТА, 0,5% BSA в PBS, рН 7,2).

1. Вымойте клеток путем центрифугирования селезенки и костного мозга при 1200 оборотов в минуту в течение 10 мин при 4 ° С и количество клеток.
2. Удалите ВСЕ супернатант. Ресуспендируют клеток костного мозга в 100 мкл на 10 млн. клеток костного мозга в буфер MACS.
3. Продолжить с использованием CD3 истощения производств »протокол.
4. Вымойте CD3 обедненного клетки костного мозга 3 раза в стерильной PBS. Граф CD3 обедненного клетки костного мозга и ресуспендируют в соответствующем объеме внедрить 10 ⁷ клеток.

6. L2G85.B6 CD8 + Т-клеток очистки

Есть множество способов, чтобы очистить CD8 Т-клеток от L2G85.B6 мышей. Кроме того, есть несколько способов, чтобы исчерпать CD8 Т-клеток от WT спленоцитов доноров. Наша лаборатория использует комплекты из Miltenyi Biotec (CD8 истощения - 130-049-401, CD8 очистки - 130-095-236).

1. Ресуспендируют WT гранул в 90 мкл буфера MACS на 10 ⁷ клеток. Продолжить с CD8 T истощение клеток в соответствии с производств "протокол (CD8 истощения - 130-049-401).
2. Ресуспендируют L2G85.B6 гранул в 40 мкл буфера MACS на 10 ⁷ клеток. Продолжить CD8 Т-клетки очистки в соответствии с производств "протокол (CD8 очистки - 130-095-236).
3. Граф каждой популяции клеток и мыть каждую населения в 3 раза стерильной PBS. Ресуспендируют каждой группы населения в соответствующем объеме внедрить 18x10 ^{6 Вт} (CD8 обедненного) спленоцитов и 2х10 ⁶ L2G85.B6 очищают CD8 Т-клеток.

7. Инъекционного препарата

1. Комбинат 10 ⁷ CD3 обедненного клетки костного мозга, 18x10 ⁶ вес (CD8 обедненного) спленоцитов и 2х10 ⁶ L2G85.B6 очищают CD8 Т-клеток в микроцентрифуге трубку. Промыть стерильной PBS и ресуспендируют в 300 мкл.
2. Inject клеточный препарат в хвостовую вену получателя мышей. Инъекции должно быть сделано с помощью иглы 28 калибра.
3. Магазин мышей в microisolator клетку с подкисленной водой. Оценка мышей ежедневно с использованием скоринга GVHD системы скоринга разработан Кук и др. ^1.

8. Bioluminescent изображений

1. Через шесть дней после пересадки, вводить получателя мышей с 4 мг D-люциферин. Разрешить 5 мин для люциферин в реакцию с люциферазы.
2. Anesthetize мыши в изофлуран камере тепловизора биолюминесценции и изображений получателям в течение 5 минут с небольшим биннинга. Это создаст изображение с высоким разрешением во время сбора столько событий, насколько это возможно.
3. Анализ данных с использованием живыхИзображение программного обеспечения. Масштабы псевдо-цветное изображение может быть изменена для получения наилучших результатов. Тем не менее, важно, что в том же масштабе быть использованы в экспериментах.
4. Регионы интересов может быть создан с помощью программного обеспечения Живые изображения и света излучение может быть определена количественно путем расчета потока (фотонов / сек), излучаемый из каждой области интереса.

9. Представитель Результаты

Примерно через 7-10 дней после пересадки, мыши начинают показывать клинические признаки РТПХ. Мыши появляются потрепанным из-за отсутствия ухода. Получатели также начнет терять вес между 7-10 дней после пересадки. Деятельность и положение получателя мышей будет оставаться относительно нормальных примерно до 12-14 дня после пересадки. Накопительное GVHD баллов будет неуклонно возрастать в течение первых 2-3 недель после трансплантации (рис. 1А). Болезнь конечно очень изменчива между мышами, однако, получатели должны равномерно поддаваться РТПХ на 30-40 гн я после пересадки (рис. 1б).

На рисунке 2 показан получателю мышей, которые были обследованы 6 дней после пересадки. Псевдо-цветная шкала показывает различной свет эмиттанса по всему телу с самой высокой интенсивности света, излучаемого в селезенке и кишечнике. CD8 Т-клеток накопление в кишечнике согласуется с предыдущими выводами ^6. Мыши-реципиенты может быть помещен обратно в клетку, чтобы microisolator быть отображены на более позднем этапе времени или эвтаназии для работы с изображениями бывших естественных условиях.

Критерии	Оценка 0	1 класс	2 класс
Потеря веса (wkly.)	<10%	> 10% - <25%	> 25%
Поза	Нормальный	Скрючившись только в состоянии покоя	Несколько скрючившись, ухудшает movemeNT
Деятельность	Нормальный	От легкой до умеренной снижение активности	Стационарные если стимулировало
Мех текстуры	Нормальный	От легкой до умеренной ероша	Тяжелая рассердило / плохой уход
Кожа Текстура	Нормальный	Масштабирование лапы / хвост	Очевидные области оголенный кожи

Таблица 1. Кук и др. разработали эту систему оценки в 1996 ^1. Мышь должна быть набрано в день на каждого из критериев слева. Каждая мышь дается счетом 0-2 для каждого критерия и общая оценка является суммой всех индивидуальных баллов.

Рисунок 1. Летально облученных BALB.B были пересажены с 10 ⁷ костейклеток костного мозга в одиночку или с 18x10 ⁶ CD8 Т-клеток обедненного WT спленоцитов и 2х10 ⁶ очищенных L2G85.B6 CD8 Т-клеток. А) Клинические данные счет получателя костного мозга в одиночку или с CD8 Т-клеток, обедненной WT спленоцитов и очищают L2G85.B6 CD8 Т-клеток. B) Данные по выживаемости реципиентов костного мозга в одиночку или с CD8 Т-клеток обедненного WT спленоцитов и очищают L2G85.B6 CD8 Т-клеток. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 2. Летально облученных мышей BALB.B были пересажены с 10 ⁷ клеток костного мозга в одиночку или с 18x10 ⁶ CD8 Т-клеток обедненного WT спленоцитов и 2х10 ⁶ очищенных L2G85.B6 CD8 Т-клеток. Получатели вводили 4 мг D-люциферин с помощью внутрибрюшинного введения и были обследованы использованием Xenogen ИВИС в течение 5 мин при малых биннинга. Pseudo цвета изображений показал, где фиолетовый представляет низкой интенсивности и красный представляет высокую регионов интенсивности интереса были сделаны по всему мыши и полного потока (фотонов / сек) были количественно.

Рисунок 3. Летально облученных мышей BALB.B были пересажены с 10 ⁷ клеток костного мозга в одиночку или с 18x10 ⁶ CD8 Т-клеток обедненного WT спленоцитов и 2х10 ⁶ очищенных L2G85.B6 CD8 Т-клеток. Получатели вводили 4 мг D-люциферин с помощью внутрибрюшинного введения и были обследованы использованием Xenogen ИВИС в течение 5 мин при малых биннинга. Псевдо-цветных изображений показал, где фиолетовый представляет низкой интенсивности и красный представляет высокой интенсивности. Получатели были обследованы на) 4-й день, B) 6-й день, и C) 8-й день почтовым переводом.

Обсуждение

Протокол для стимулирования РТПХ у мышей, представленные здесь представляет собой клинически значимые модели мышиной РТПХ. Первоначально установленный Berger и соавт. В 1994 году, C57Bl / 6 в комбинации штамм BALB.B является MHC-соответствие с РТПХ смертности опосредовано CD4 зависимым, CD8 Т-эфф...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
RPMI 1640	Invitrogen	12633-012
Эмбриональной телячьей сыворотки	Invitrogen	10439016
40 мкМ фильтр сотовый	BD Biosciences	352340
CD3e-биотин	Miltenyi Biotech	130-093-021
Anti-биотин микрошарики	Miltenyi Biotech	130-091-147
CD8a микрошарики	Miltenyi Biotech	130-049-401	Используется для разрушающих CD8 Т-клетки из селезенки.
CD8a Очистка антител коктейль	Miltenyi Biotech	130-095-236	Используется для очисткиCD8 Т-клетки из селезенки.
D-Luciferin	Суппорт Life Sciences	122796