JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • протокол
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Быстрый и эффективный способ для интеграции чужеродной ДНК интерес в готовых акцептором штаммов, называемых штаммов посадочной площадки, описан. Метод позволяет на конкретных участках интеграции ДНК кассету в инженерных локус площадку приземления данного штамма, через сопряжение и выражения ΦC31 интегразы.

Аннотация

Бактериальной хромосомы могут быть использованы для поддержания стабильно чужеродной ДНК в мега-база от 1. Интеграция в хромосому обходит такие вопросы, как плазмиды репликации плазмиды стабильности, плазмиды несовместимости, и плазмиды дисперсии числа копий. Этот метод использует сайт-специфические интегразы из Streptomyces фага (Φ), C31 2,3. ΦC31 интегразы катализирует прямой рекомбинации между двумя определенными участками ДНК: attB и attP (34 и 39 б.п. соответственно), 4. Это рекомбинация является стабильной и не возвращается 5. "Посадочная площадка" (LP) последовательность, состоящая из спектиномицину ген устойчивости, Aada (СРП), и Е. палочки бета-глюкуронидазы ген (uidA) в окружении сайтов attP была интегрирована в хромосомах Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi и Agrobacterium tumefaciens в межгенных региона, утрапКл локус, и тета локус, соответственно. С. meliloti используется в данном протоколе. Mobilizable векторы донора содержащие attB сайтов фланговые писака красный флуоресцентный белок (RFP) гена и гена устойчивости к антибиотикам, также были построены. В этом примере гентамицина устойчивы плазмиды pJH110 используется. Ген RFP 6 может быть заменен на желаемую конструкцию использованием Sph я и Pst I. Кроме того синтетическая конструкция в окружении attB сайты могут быть суб-клонирован в вектор mobilizable таких как pK19mob 7. Выражение ΦC31 интегразы гена (клонированы из pHS62 8) приводится в движение промоутер лак на mobilizable широкий спектр хозяин плазмиды pRK7813 9.

Tetraparental протокола спаривания используется для передачи доноров кассету в LP штамм тем самым заменив маркеры в последовательности LP с донорами кассету. Эти клетки являются переходыS-интегрантов. Транс-интегрантов формируются с типичной эффективностью 0,5%. Транс-интегрантов которые обычно встречаются в первые 500-1000 колонии экранируется чувствительность к антибиотикам или сине-белые скрининга с использованием 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-глюкуроновой кислоты (X-Gluc). Этот протокол содержит спаривания и процедуру отбора для создания и выделения транс-интегрантов.

протокол

1. Производство культуры

  1. Подготовка стерильных жидких сред: TY 10 (5 г / л триптон, 3 г / л дрожжевого экстракта, 0,44 г / л хлорида кальция обезвоживания) и LB 11 (10 г / л триптон, 5 г / л дрожжевого экстракта, 5 г / хлорид натрия, рН 7).
  2. Инокулировать из одной колонии: SmUW227 (С. meliloti LP-деформированного: строительство будут описаны в другом месте, процедить деталей конструкции по запросу) () в 5 мл TY СМИ с 50 мкг / мл спектиномицину. Привить следующие штаммы в 5 мл среды LB жидкости, дополняя данный антибиотик: Е. палочки DH5α 12, содержащий pJC2, интегразы выражение плазмида, с 10 мкг / мл тетрациклина, Е. палочки MT616 13, мобилизатор, с 10 мкг / мл хлорамфеникола и E. палочки DH5α содержащие pJH110, донор кассеты плазмиды, с 5 мкг / мл гентамицина.
  3. Инкубируйте E. штаммов кишечной ночь на 37 иградусов, в постоянной тряски. Инкубируйте С. meliloti деформации при 30 ° C в течение двух дней при встряхивании. Это позволило получить С. meliloti культуры ночь с большей посевной (1:500 субкультура насыщенного культуры).

2. Подготовка культуры и смешивания

  1. Промойте 1,5 мл культуры каждого штамма, собирая осадок клеток путем центрифугирования при 17000 х г в течение 30 секунд и ресуспендирования в 1 мл стерильного 0,85% NaCl; повторить один раз.
  2. Ресуспендируют осадок в 100 мкл стерильного 0,85% NaCl.
  3. Индивидуально обнаружить 10 мкл промытый культуры для каждого штамма на равнине пластины агар TY. Эти пятна контроль пятна.
  4. Добавить 40 мкл каждого штамма исключением E. палочки DH5α 12, содержащий pJC2 в стерильную пробирку, перемешайте и место 120 мкл этой смеси на равнине пластины агар TY. Это место не-интегразы отрицательного контроля.
  5. Добавить 40 мкл каждого штамма в стерильном тВБО, перемешать, и место 160 мкл этой смеси на равнине пластины агар TY. Это место IMCE место спаривания.
  6. Позвольте мест для просушки в ламинарном боксе.
  7. Уплотнение пластин и инкубировать при температуре 30 ° С в течение ночи.

3. Выделение Транс-интегрантов

  1. Подряд контроль пятен и IMCE место на пластинах агар TY дополнен 200 мкг / мл стрептомицина (SmUW227 основан на Rm1021 который несет в себе мутацию присвоении высокого уровня устойчивости к стрептомицину 14) и 30 мкг / мл гентамицина.
  2. Для расчета эффективности IMCE, ресуспендируют примерно четверть IMCE место спаривания в 500 мкл стерильного 0,85% NaCl. Сделать 10 раз серийные разведения до 10 -7. Пластина разведения 10 -2 до 10 -5 на TY агаром дополнен 200 мкг / мл стрептомицина и 30 мкг / мл гентамицина, чтобы выбрать для транс-интегрантов. Пластина разведении 10 -3 Четух 10 -7 на TY агаром дополнен 200 мкг / мл стрептомицина, чтобы выбрать для транс-интегрантов и потенциальных получателей, то есть общий получателей.
  3. Для изоляции безмаркерных транс-интегрантов ресуспендируют примерно четверть IMCE место спаривания в 500 мкл стерильного 0,85% NaCl. Сделать 10 раз серийные разведения до 10 -6. Пластина разведения 10 -4 до 10 -6 на четырех TY агаром дополнен 200 мкг / мл стрептомицина и 200 мкг / мл X-Gluc.
  4. Инкубируйте пластины при температуре 30 ° С в течение 3 дней.
  5. Просмотр RFP транс-интегрантов в зеленом свете (525 нм) и через красный светофильтр (> 610 нм) 15.
  6. Расчет эффективности процентов IMCE как КОЕ транс-интегрантов по сравнению с КОЕ от общего числа получателей. Примерно половина из транс-интегрантов будет прошли истинный обмен кассета делая их белыми и спектиномицину чувствительны.
  7. Чтобы найти безмаркерных транс-интегрантов (безЗдесь донор вектор не содержат ГМ-т, как в pJH110) экрана для белого колонии (длительный период инкубации 1-2 дополнительных дня при комнатной температуре, будет способствовать дифференциации колоний через X-Gluc, это необходимо в С. meliloti SmUW227), подтвердить спектиномицину чувствительность колонии путем скрининга на пластинке агара TY без антибиотиков и пластин TY агар, содержащий 100 мкг / мл спектиномицину.

4. Представитель Результаты

После трех дней инкубации на TY дополнить стрептомицин и гентамицин контроль полосы не должно быть роста. IMCE полоса должна быть сплошной рост на полосу головы и многих колониях на вторую полосу, как показано на рисунке 2. Эффективность транс-интеграции, выраженное как доля транс-интегрантов к общему получателей, должна быть в пределах 0,5%. Примерно половина из транс-интегрантов будет спектиномицину чувствительные и белыхпоказывая, что они прошли истинный обмен кассету. Транс-интегрантов содержащие доноры тестер ППП кассету с pJH110 должен отображать заметной флуоресценции ППП, если смотреть под зеленым светом (525 нм) и через красный светофильтр (> 610 нм) 15.

figure-protocol-5231
На рис. 1 Сопряжение смесь иллюстрации: С помощью выражения передачи генов от pRK600, все плазмиды передаются случайно от клетки к клетке. Эта передача результатов в создании транс-интегрантов в смеси, за счет приобретения LP-штамма из двух плазмид, необходимых для IMCE, интегразы (INT) вспомогательные плазмиды pJC2 и доноров плазмиды pJH110. Донорами кассету с не-доноров репликации плазмиды (pJH110) обменивается через ΦC31 интегразы деятельности с маркерами LP-кассеты на хромосоме, в результате чего потери LP-маркеров (Spг, uidA) и содержание доноров кассеты (RFP и Gm г) в появившемся транс-интегрирующий.

figure-protocol-6010
Рисунок 2. . Спаривание месте табличку на неселективные TY пластина показывает сухие смеси ячейки поверхность агара B: Спаривание пятна штрихом на стрептомицин-гентамицин-X-Gluc пластины, из левого верхнего угла по часовой стрелке, не интегразы контроля, IMCE в S. meliloti, Е. палочки DH5α содержащие pJC2 контроль, Е. палочки DH5a содержащие pJH110 контроль, Е. палочки MT616 контроля и С. . meliloti UW227 контроль C: 10 -2 разведения спаривания ресуспендирования пятно на стрептомицин TY-X-Gluc агар D:. 10 -2 разведения спаривания ресуспендирования пятно на TY стрептомицин-гентамицин-X-Gluc агар (синие колонии одного рекомбинантов, белые колонии прошли истинной. кассеты обмен) E: 10 -2 разведения спаривания место ресуспендирования на TY стрептомицин-X-агар Gluc указывает на отсутствие флуоресценции F:. 10 -2 разведения спаривания ресуспендирования пятно на TY стрептомицин-гентамицин-X-Gluc агар с изображением двух уровней флуоресценции (ярче колонии соответствуют синих колоний и имеют более высокую ЗП выражение предположительно из-за промоутера для чтения, хотя из векторных последовательностей, где колонии пройдя истинного кассеты обмен содержать ППП только с непосредственной промоутер, не для чтения через от промоутера в лак вектор, который отсутствует.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

IMCE техника позволяет эффективно интегрировать одного attB окружении ДНК кассету в LP-локус ранее инженерии штамм. Как только желаемый конструкция клонированных вместо ППП для создания доноров кассеты, техника не требует последующей очистки ДНК и трансформации, что делает его о...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Для Маргарет Смит CM за любезно предоставленные интегразы клон
Финансирование поддержки:
Геном Канада / Геном Prairie
NSERC Discovery и стратегических проектов гранты

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Название реагента Компания Номер по каталогу Комментарии
Стрептомицин Bioshop Канада Инк STP101
Спектиномицин Bioshop Канада Инк SPE201
Гентамицин Bioshop Канада Инк GTA202
Choramphenicol Bioshop Канада Инк CLR201
Тетрациклин Bioshop Канада Инк TET701
Канамицин Bioshop Канада Инк KAN201
Бактериологическое качество агара Bioshop Канада Инк AGR001
Триптон Bioshop Канада Инк TRP402
Дрожжевой экстракт Bioshop Канада Инк YEX401
Хлористый натрий Bioshop Канада Инк SOD001
Хлорид кальция Bioshop Канада Инк CCL444
X-Gluc Золото Биотехнологии Инк G1281C1
Кишечной палочки штамма MT616 Предоставляется по запросу Также используется за пределами нашей лаборатории
Кишечной палочки штамма pJC2 В доме, предоставляется по запросу
Кишечной палочки штамма pJH110 В доме, доступных по требовант
SmUW227 деформации В доме, предоставляется по запросу

Ссылки

  1. Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).
  2. Kushtoss, S., Rao, R. N. Analysis of the Integration Function of the Streptomycete Bacteriophage FC31. J. Mol. Biol. 222, 897-908 (1991).
  3. Brown, W. R., Lee, N. C., Xu, Z., Smith, M. C. Serine recombinases as tools for genome engineering. Methods. 53, 372-379 (2011).
  4. Groth, A. C., Olivares, E. C., Thyagarajan, B., Calos, M. P. A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5995-6000 (2000).
  5. Rowley, P. A., Smith, M. C., Younger, E. A motif in the C-terminal domain of FC31 integrase controls the directionality of recombination. Nuc. Acid. Res. 36, 3879-3891 (2008).
  6. Campbell, R. E. A monomeric red fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 7877-7882 (2002).
  7. Schafer, A. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutumicum. Gene. 145, 69-73 (1994).
  8. Thorpe, H. M., Smith, M. C. In vitro site-specific integration of bacteriophage DNA catalyzed by a recombinase of the resolvase/invertase family. Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 5505-5510 (1998).
  9. Jones, J. D., Gutterson, N. An efficient mobilizable cosmid vector, pRK7813, and its use in a rapid method for marker exchange in Pseudomonas fluorescens strain HV37a. Gene. 61, 299-306 (1987).
  10. Beringer, J. E. R Factor transfer in Rhizobium leguminosarum. J. Gen. Microbiol. 84, 188-198 (1974).
  11. Lennox, E. S. Transduction of linked genetic characters of the host by bacteriophage P1. Virology. 1, 190-206 (1955).
  12. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557-580 (1983).
  13. Charles, T. C., Finan, T. M. Genetic map of Rhizobium meliloti megaplasmid pRmeSU47b. J. Bacteriol. 172, 2469-2476 (1990).
  14. Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 6231-6235 (1985).
  15. Heil, J. R., Nordeste, R. F., Charles, T. C. The fluorescence theatre: a cost-effective device using theatre gels for fluorescent protein and dye screening. Can. J. Microbiol. 57, 339-342 (2011).
  16. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
  17. Lesic, B., Rahme, L. G. Use of the lambda Red recombinase system to rapidly generate mutants in Pseudomonas aeruginosa. BMC Mol. Biol.. 9, 20-20 (2008).
  18. Choi, K. -H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Protocols. 1, 153-161 (2006).
  19. Thomason, L. C., Calendar, R., Ow, D. W. Gene insertion and replacement in Schizosaccharomyces pombe mediated by the Streptomyces bacteriophage FC31 site-specific recombination system. Molecular Genetics and Genomics. 265, 1031-1038 (2001).
  20. Katzen, F. Gateway recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin. Drug Discovery. , 571-586 (2007).
  21. Charles, T. C., Doty, S. L., Nester, E. W. Construction of Agrobacterium strains by electroporation of genomic DNA and its utility in analysis of chromosomal virulence mutations. Appl. Environ. Microbiol. 60, 4192-4194 (1994).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

61C31Rhizobiales

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены