Полированные и железобетона тоньше череп-Window для долгосрочных изображений из мозга мыши

Резюме

Представлен метод формирования изображения окна в мышь череп, который охватывает миллиметров и стабилен в течение месяца без воспаление головного мозга. Этот метод хорошо подходит для продольного исследования кровотока, клеточной динамики, и клетка / сосудистые структуры с использованием двух-фотонной микроскопии.

Аннотация

В естественных изображений корковых функций требует оптического доступа к мозгу без нарушения внутричерепного окружающей среды. Представлен метод формирования полированного и железобетонных разбавленной черепа (портов) в окно мыши череп, который охватывает несколько миллиметров в диаметре и стабилен в течение месяца. Череп разбавленной от 10 до 15 мкм в толщину с ручной буровой для достижения оптической прозрачностью, а затем обложил цианакрилатного клея и покровного стекла: 1) обеспечивает жесткость, 2) подавляют костный подроста и 3) уменьшить рассеяние света от неровностей на поверхности кости. С черепа не нарушена, любое воспаление, которое может повлиять на процесс изучается значительно снижается. Изображений глубине до 250 мкм ниже поверхности коры может быть достигнуто с помощью двухфотонного лазерной сканирующей микроскопии. Это окно хорошо подходит для изучения мозгового кровотока и клеточной функции как наркоз и проснуться препаратов. Кроме того, он предлагает опможность управлять клеточной активности использования optogenetics или нарушать кровоток в сосудах целевых облучения циркулирующего фотосенсибилизаторов.

протокол

1. Подготовка к операции ^я

1. Очистите хирургических инструментов, sonicating в смеси Maxizyme и хирургических молока в ультразвуковой очиститель. Автоклава хирургические инструменты перед каждым экспериментом.
2. Убедитесь, что все необходимые реагенты и расходные материалы имеются. Список реактивов и расходных материалов приведены в таблице 2. Реагенты и расходные материалы, которые вступают в контакт с открытыми ткани должны быть стерильными, когда это возможно.
3. Вызвать анестезии. Типичные анестетики подходит для выживания исследования представлены в таблице 1. Убедитесь, хирургический наркоз плоскости, проверяя отсутствие ног рефлекс крайнем случае. Оптимальный возраст мыши составляет от 3 до 6-недельного возраста. Черепов молодых мышей являются более мягкими и тонкими трудно. Пожилые мышей толще черепа, которые будут кровоточить еще во время прореживания процедуры.
4. Защита животных в стереотаксической раме ^1. Список хирургического оборудования приведены в таблице 2.
5. Поддержание температуры телатуры при 37 ° C с использованием обратной связи регулируется ректального датчика и тепло панели.
6. Применение глазной мази для глаз, чтобы сохранить влагу.
7. Бритье головы с небольшой электрической бритвой.
8. Очистите кожу головы Бетадин, а затем потереть на 70% (объем / объем) изопропилового спирта.
9. При желании, убедитесь, что сердца и дыхания находятся в пределах нормального диапазона использования пульсоксиметр. Для мыши, эти цифры должны центре около 10, 2 Гц, соответственно.
10. Теплый аликвоту стерильной фильтрацией искусственной спинномозговой жидкости (ACSF) до 37 ° C (125 мМ NaCl, 10 мМ глюкозы, 10 мМ HEPES, 3,1 мМ CaCl _2, 1,3 мМ MgCl _2, рН 7,4), (все химические вещества из Sigma) ^2.

2. Монтаж Глава кадров

1. Снимите кожу головы в течение всей спинной поверхности черепа с парой щипцов и хирургические ножницы. Обрежьте кожу с боков до краев височных мышц с обеих сторон черепа и послеerior для мышц шеи (рис. 1А).
2. Используйте лезвие скальпеля для удаления тонких надкостницы с поверхности черепа.
3. Очистите череп с влажным хлопок наконечником аппликатором и сухой поверхности черепа с потоком воздуха от пыли может. Затем нанесите тонкий слой клея цианакрилатного по всей поверхности черепа. Дайте клею высохнуть. Этот слой клея, необходимые для надлежащего соблюдения зубного цемента в последующих шагах. Цианакрилатного клея не должны быть стерилизованы.
4. Прикрепите металлический разъем на поверхности черепа, от области нужное окно. Для анестезии препаратов, небольшая гайка может быть прикреплен к черепу с прикосновением цианакрилатного клея, который впоследствии может быть пьяным в изображение установки с помощью болтов (рис. 1B, 1L и 1N). Печать заднюю гайку с лентой, чтобы клей не входит в темы во время прикрепления к черепу. Гайки и лента должна быть стерилизована в автоклаве до операции.
5. Для подготовки изображения проснулся, придают более жесткие пользовательский разъем с двумя точками крепления (рис. 1М и 1Н). Просверлите два отверстия в черепе по противоположной коры полушария с половиной мм сверло заусенцев, а затем ввести два # 000 саморезов. Эти винты поможет закрепить голову монтировать к черепу. Наносить только на один полный оборот винта, чтобы избежать давления на основного мозга. Затем приложите пользовательские панели крест металла с небольшим прикосновением цианакрилатного клея на мозжечке. Позвольте цианакрилатного клей полностью высохнуть. Этот металл разъем значительно сокращает число степеней свободы и упрощает перемещение той же области изображения в продольных исследованиях. Широкий бар крест дает широкие возможности для размещения электродов и стимуляции вибриссы. Подробные планы создания пользовательских крепление головы и крепление устройств можно ознакомиться в Интернете (зики / links.html "> http://physics.ucsd.edu/neurophysics/links.html). винты и перекладина должны быть стерилизованы в автоклаве до операции.
6. Покройте всю поверхность черепа, за исключением расположения окна слоем стоматологического цемента (рис. 1С и 1D). Убедитесь, что все открытые края кожи покрыты цементом. Компоненты зубной цемент не должны быть стерилизованы.

3. Генерация полированные и усиленные тоньше, череп (портов) в окне

1. Убедитесь, что сверло заусенцы остры и избежать их повторного использования. Использование низких скоростях на бормашины, тонкий 2 мм на 2 мм регионе за соматосенсорной коры с половиной мм заусенцев. Переключение между смачивания череп с ACSF и сушки поверхности черепа с нежным потоком воздуха от газов тряпкой, мокрый для охлаждения, и сухой для разбавления. Это требует прореживания через губчатый слой черепа, которые могут кровоточить, но могут быть проверочныеред, смывая с ACSF (рис. 1д). Череп начинает сгибаться под небольшим давлением буровой, когда она составляет ~ 50 мкм, и мягкой мозговой оболочки сосудов должны быть видны через мокрую кости (рис. 1е). При этом толщина, небольшие белые пятна в кости становятся видимыми на несколько секунд сразу после сухой поверхности черепа увлажняется.
2. На данный момент, тонкие кости еще больше. Используйте медленный дрели, т.е. 1000 оборотов в минуту, который бреет поверхности черепа и только легким касанием. Использование небольших контролируемых движений, держа сверло, как перо, и только применить силу в боковом направлении. Кость должна быть ~ 10 до 15 мкм на конечной толщины (рис. 1Г). Когда кости достаточно тонкие, мелкие белые пятна в кости больше не будет видна, когда сухой поверхности черепа увлажняется.
3. Польские окна региона порошка оксида олова. Прикрепить готовых сверло, которое опускают в аквариум силиконовым герметиком и собращается, в результате чего конической кнут (вставка на рис. 1 полугодие). Силиконовые кнут должен быть готов по крайней мере за день до операции, и стерилизовать 70% изопропанола до использования. Нанесите небольшое щепотка порошка на окно вместе с каплей ACSF (рис. 1 полугодие). Перемешивать раствор в окно на срок до десяти минут, осторожно касаясь кончиком бича движущихся к поверхности черепа. Смыть порошок оксида олова полностью из окна с помощью ACSF и сухой кости тщательно струю воздуха. Неровности поверхности и сторонник чипов кости оставленные бурение на предыдущих этапах, должны быть удалены после полировки (рис. 1 полугодие и 1I). Порошок оксида олова не должны быть стерилизованы.
4. Вырезать квадратных куска нет. 0 остекление немного меньше, чем размер окна. Используйте писец мягко забить отделены горизонтальными и вертикальными линиями в покровным стеклом с использованием прямой край. Затем положите крышку скольжения в чашку Петри и кпОка блюдо на край стола, чтобы отделить осколки стекла. Весь чашке Петри может быть автоклаве для обеспечения стерильности.
5. Поместите соответствующего размера покровного стекла рядом с сухой окна. Нанесите небольшое прикосновение цианакрилатного клея над окном с помощью иглы сломанных деревянных аппликатор хлопок, и быстро нажать нарезанные части покровного стекла поверх клея. Избегайте создания пузырьков под покровного стекла. Аккуратно надавите на крышку стекла на поверхности черепа, и удерживайте в течение нескольких секунд (рис. 1J и 1O). Дайте клею высохнуть в течение 15 минут. Превышение цианакрилатного клея могут быть удалены из верхней поверхности покровного стекла с лезвие скальпеля после его высушивают. Печать края покровного стекла с зубным цементом и образуют слегка приподняты и удерживать воду для погружения линз (рис. 1K и 1O).

4. Восстановление

1. Поместите животное в теплой операции следующие клетки. Мониторингживотное периодически, пока он полностью оправится от анестезии.
2. Если препарат предназначен, чтобы выжить в течение более одного дня, обеспечить бупренорфин (0,03 мкг на грызунах г) для обезболивания. Мы обычно изображение животного хотя бы один день после первоначального внедрения.

5. Подготовка изображений

1. Стабилизация животных на оптический макет для работы с изображениями, используя кадр как руководитель поддержки (Рис. 1L и 1M). Сдержанность аппарат может быть изготовлен из коммерчески доступных компонентов оптико Qioptiq или ThorLabs. Наша отдельная пластина может транспортироваться между хирургическим и двухфотонного изображения люксы с животными, и все физиологические устройств мониторинга собраны в единое целое ^3.
2. Если изображение кровотока желательно, вводят 0,05 мл 5% (вес / объем) флуоресцентных красителей-декстран растворенного в стерильном физиологическом растворе или через хвостовую вену или вены подглазничной для обозначения сыворотке крови (рис. 2A и 2C-2H ) ^4-7. Это должно быть сделано под общим наркозом. Подглазничной администрации вены может быть проще для начинающих, как декстран решения более вязкой. Хвостовую вену может быть трудно найти в темной мышей, а вены заметно снижается после неудачной инъекции. Для визуализации сосудистой с зеленым излучением, использовать изотиоцианат флуоресцеина декстран. Для излучения красного, использовать Texas Red декстран. С высоким молекулярным весом декстраны, краска останется в обращении в течение нескольких часов. Кроме того, животные с эндогенными флуоресцентные метки могут быть отображены непосредственно в соответствующих двухфотонного возбуждения волны. Решение декстран могут быть заморожены в порции для использования в будущем.
3. Аккуратно очистите поверхность окна влажной хлопок наконечником аппликатором.
4. Для длительной визуализации анестезии препараты, вводят внутрибрюшинно раствор стерильной лактата Рингера в объеме 3 мкл на грамм каждые 2 часа, чтобы поддерживать тело жидкости и энергетических потребностей.
5. Когда изображение животных в бодрствующем состоянии, подголовники ограничивают лишь несколько часов в то время, чтобы снизить уровень стресса. Вернуть животное в дом клетке между изображениями сессий для пищи и воды.

6. Представитель Результаты

Успешный окно позволит изображений глубине до 250 мкм ниже пиальных поверхности в течение нескольких месяцев. Этот метод был использован для изучения в естественных условиях капиллярного кровотока ^{4, 8,} активации микроглии ^{8, 9,} и дендритные структуры в корковой паренхиме ^8. В одном примере, мы используем двухфотонного изображения, чтобы показать коры сосудистой из наркоза Thy1-желтый флуоресцентный белок (YFP) мыши, после того, как в сыворотке крови помечена внутривенного введения декстрана Texas Red (рис. 2). Dural суда часто видны чуть выше поверхности коры в твердой мозговой оболочки (рис. 2, стрелки). Большой мягкой мозговой оболочки артериол и венул лие на поверхности коры (рис. 2D). Проникающие отделение суда от этой сети поверхность и погружение в коре, где они разветвляются в плотную капиллярного русла, которая кормит корковой ткани (рис. 2, д-2H). Дендритных беседки глубокой YFP выражения корковых нейронов, сигнал эндогенного этой линии мышей, могут быть отображены одновременно во втором канале ¹⁰ (рис. 2, б-2H). Второй гармоники сигнала кости были собраны в третий канал, и может быть использован для оценки толщины разбавленной черепа после сбора изображений стеков (рис. 2, в 2С).

Корковые сосудистой динамика глубокое воздействие анестетиков ^11. Во втором примере мы покажем, видео спонтанного vasoactivity собранные двухфотонной микроскопии от привыкшей спать мыши. Известный колебаний вазомоторный в диаметре просвета видны с пиальных артериол, а не с соседней венулы. Этобазальных спектр vasoactivity уменьшается с ⁴ уретана анестезии. Для количественной оценки спонтанных и вызванных изменениями в кровоток, мы используем адаптирована линия методы сканирования, чтобы захватить как сосудистый диаметр и красных кровяных телец скорости отдельных судов. Подробная ресурсов на количественные изображения кровотока с помощью двух-фотонного микроскопа имеются ^{3, 12.}

Рисунок 1. Порядок окно портов. (К) Изображения последовательных шагов в процедуре создания портов окна. См. текст для подробных инструкций. β = брегмы и λ = лямбда. (L) болт и гайка на голову во время съемки из наркоза препаратов. (М), пользовательских обрабатываются крест крепление головы планку бодрствования препаратов. В этом примере, разъем был имплантирован для повторной записи ЭГ. (N)Схема показывает вид сверху горы головы и положение различных компонентов. Гайки, используемые в панели L предназначен как альтернатива перекладину использования в панели М. Два # 000 саморезов добавляются с поперечиной крепления для дополнительной устойчивости с препаратами проснулся изображений. (O) Схема показывает сечение окна портов.

Рисунок 2. Двухфотонного визуализации сосудистой и нейронные структуры коры мыши. Все изображения были собраны через окно портов в Thy1-YFP мышь через 2 дня после того, как окно имплантации ^10. Максимальный прогноз более 150 мкм ткани в корональной ориентации показывает разбавленной черепа по отношению к сосудистой (A) и дендритов (B). Кости (синий) было обнаружено, собирая второй гармоники флуоресценции при 450 нм излучения с 900 нм возбуждение ^{8. Сосудистой (красный) была помечена внутривенно 70 кДа Texas Red декстран 6. Дендритные поля нейронов (зеленого цвета) являются эндогенными для Thy1-YFP линии трансгенных мышей. (CH) Максимальная прогнозы более чем на 50 мкм тканей в горизонтальной ориентации на различных глубинах под мягкой. Данные за тот же стек изображение, показанное в панели А и В. Dural суда могут быть видны только выше поверхности коры (стрелка на C).}

Сокращения

ACSF = искусственной спинномозговой жидкости
Порты = полированной и железобетонных разбавленной черепа окно
YFP = желтый флуоресцентный белок

^я Убедитесь, что процедуры, описанные утверждаются локальной Уходу за животными и использование комитета.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Двухфотонного изображений через окно портов требует передачи через разбавленной костей и твердой мозговой оболочкой, которая ослабляет свет лазера и добавляет оптических аберраций на больших глубинах ^8. Однако, несмотря на этот недостаток, изображения глубиной до 250 мкм ниже пи?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Агент	Маршрут доставки	Доза для мыши	Продолжительность	Примечания	Источник	Работы работы
Фенобарбитала (Nembutal)	IP	90 мкг / г	15-60 мин	Ограниченный запас прочности. Работа до надлежащую дозу наркоза медленно. Дополнение 10% от индукционной дозы по мере необходимости.	036093, Шейн Батлер	7
Кетамин (Ketaset), смешанного с Ксилазин (Anased)	IP	60 мкг / г (К) 10 мкг / г (X) (соединение в одном шприце)	20-30 мин	Ксилазин совместно вводят как мышечный релаксант и анальгетик. Дополнение только кетамина на 50% индукции дозу по мере необходимости.	(K) 010177, (X) 033198; Шейн Батлер	7
Изофлюран (Isothesia)	Вдыхание	4% означает, альвеолярной концентрации (ПДК) для индукции; 1-2% MAC для обеспечения	4-6 часов.	Предоставляется в смеси из 70% кислорода и 30% закиси азота. Длительная анестезия приводит к медленному восстановлению.	029403, Шейн Батлер	26

ПУНКТ	КОМПАНИИ	КАТАЛОГ # / МОДЕЛЬ
Бетадин	Шейн Батлер	6906950
Бупренорфин (Buprenex)	Шейн Батлер	031919
Флуоресцеина изотиоцианат декстран, 2 МДа молекулярной массой	Сигма	FD2000S
Изопропиловый спирт	Рыбак	AC42383-0010
Лактата раствор Рингера	Шейн Батлер	009846;
Раствор лидокаина, 2% (объем / объем)	Шейн Батлер	002468
Солевой	Шейн Батлер	009861
Хирургическое молока	Шейн Батлер	014325
Texas Red декстрана 70 кДа молекулярной массой	Invitrogen	D1864
Maxizyme	Шейн Батлер	035646
Расходные материалы
Карбида заусенцев, 1/2 мм размер сопла	Изобразительных средств наук	19007-05
Cottoned аппликаторы наконечник	Fisher Scientific	23-400-100
Крышка стекла, нет. 0 толщины	Томас Научно	6661B40
Цианакрилатный клей	ND промышленности	31428 H04308
Газ тряпкой	Newegg	N82E16848043429
Порошок сцепление цемента	Dentsply	675571
Сцепление цементного растворителя	Dentsply	675572
Инсулиновый шприц, объемом 0,3 мл с иглой 29,5	Шейн Батлер	018384
Гайку и болт для обеспечения головы	Конденсаторы	Орех, H723-ND, болт, R2-56X1/4-ND
Офтальмология мазь	Шейн Батлер	039886
Скальпель лезвия	Fisher Scientific	12-460-448
Винты, саморезы # 000	СО Morris компании	FF000CE125
Силиконовый герметик аквариум	Производство Perfecto	31001
Порошок оксида олова	Мама Минералов	EQT-TINOX
ОБОРУДОВАНИЕ
Стекло писец	Fisher Scientific	08-675
Препаровальная лупа	Carl Zeiss	OPMI FC-1
Электрическая дрель	Foredom или Осада	K.1020 (Foredom) или EXL-M40 (Осада)
Электрическая бритва	Wahl	Серия 8900
Пинцет, Дюмон нет. 55	Изобразительных средств наук	11255-20
Обратная связь регулируемой площадке тепло	FHC	40-90-8 (ректальные термистор, 40-90-5D-02, честь площадки, 40-90-2-07)
Изофлюран испаритель	Ohmeda	IsoTec4
Пульсоксиметр	Старр наук о жизни	MouseOx
Отвертка, миниатюрные	Гаррет Уэйд	26B09.01
Стереотаксической кадров	Kopf Instruments	Модель 900 (с помощью мыши маска анестезией и не разрыв уха бары)
Хирургические ножницы, тупым концом	Изобразительных средств наук	14078-10
Ультразвуковой очиститель	Fisher Scientific	15-335-30