Синтез<em&gt; В естественных условиях</em&gt; МРТ обнаруживаются Апоптоз Probe

Резюме

Раннее выявление апоптоза может выявить группы риска клетки в самых разных заболеваний. Здесь мы покажем способ связать ранний апоптоз обнаружения белка (Аннексин V) к МРТ обнаруживаются наночастицы оксида железа (Спио). Этот метод может быть распространен и на другие белки, представляющие интерес для создания МРТ обнаруживаются молекулярных зондов изображения.

Аннотация

Сотовые апоптоз является характерной чертой многих заболеваний, и это запрограммированная смерть клетки обычно происходит до клинических проявлений болезни очевидны. Средства для обнаружения апоптоза в его ранних, обратимых стадиях бы позволить себе доклинических «окно» в течение которых профилактических или лечебных мероприятий могут быть приняты для защиты сердца от повреждений. Мы представляем здесь простой и надежный метод сопряженных человека Аннексин V (ANX), которые активно связывается с клетками на ранних, обратимых стадиях апоптоза, в суперпарамагнитных оксида железа (Спио) наночастиц, которые служат МРТ обнаруживаются контрастное вещество. Сопряжение метод начинается с окисления наночастиц Спио, который окисляет карбоксильных групп на полисахарид оболочки Спио. Очищенный белок ANX затем добавляется в условиях решение борат натрия для облегчения ковалентного взаимодействия с ANX Спио в восстановительной буфера. Заключительного этапа сокращения натрия borohydridэлектронной осуществляется завершить сокращение, а затем реакция угасает. Неконъюгированного ANX удаляется из микс микроцентрифужных фильтрации. Размер и чистота ANX-Спио продукт проверяется динамического рассеяния света (DLS). Этот метод не требует дополнение или изменение, полисахарид Спио оболочки, в отличие от сшитых частиц оксида железа, методы сопряжения или биотин-меченых наночастиц. В результате, этот метод представляет собой простой, надежный подход, который может быть продлен до сопряжения других белков, представляющих интерес.

протокол

По материалам предварительного исследования ^1.

1. Сопряжение Аннексин V в Спио

1. Окислять Спио частиц (Ocean Nanotech Inc, 5 мг / мл) в течение 1 часа при 20 ° С в темное время суток в растворе 0,15 М натрий периодатом (NAIO ₄₎ (4:01 вес: весу) ^2.
2. Инкубируйте окисленных Спио в течение 12 часов с очищенной ANX белком (1:1, вес: вес) в 0,15 М борат натрия (Na ₂ B ₄ O ₇ 10H ₂ O) при 20 ° C.
3. Уменьшить смесь далее в течение 1 часа боргидридом натрия (NaBH ⁴⁾ под вытяжкой, а затем тушить с 0,15 М Трис-HCl.
4. Отделите от свободных ANX ANX-Спио центрифугированием при 14000 мкг (75 мкм пор микроконтроллер фильтр Millipore, Billerica, MA).
5. Дальнейшие уточнения соединения путем удаления несвязанного примесей с помощью магнитного сепаратора устройства (Ocean Nanotech, Inc.)
6. Количественная фильтр ретентат (ANX-Спио) белкапо Бредфорда белка и хранят при -80 ° C в дозе 2 мг / мл в 0,1 М Трис-HCl 1% сывороточного альбумина и ингибиторы протеазы (Halt ингибитор протеазы, Thermo Scientific, 1-50 мг / мг ANX).

2. Динамического рассеяния света

1. Отдельно разбавить Спио и ANX-Спио в PBS с оптической плотностью 0,1 и анализа динамического рассеяния света в Zetasizer Nano DLS машины (Malvern Inc, Вустершир, Великобритания) ^3.
2. Получить мономодальных пики (в идеале) для соединения с Z-средний размер частиц и полидисперсности (PDI). Сравните размер DLS-измерений размеров наночастиц оксида железа в одиночку. ANX-Спио DLS Результаты показали, сопряженных гидродинамических диаметр частиц 78 нм с PDI 0.13 ^1, отражающих однородные ANX-Спио видов ^3.

3. Культуры клеток, индукции апоптоза в культуре, и МРТ культивируемых клеток

1. Культура взрослой мыши костного мозга мезенхимальные стемпература клеток (mMSCs) в DMEM с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина стрептомицин (Invitrogen, Inc), предпочтительно при прохождении 20-30 ^4.
2. Индуцировать апоптоз в культуре клеток для лечения различных раза при 37 ° C с DOX (Sigma, 1 мм в 0,9% раствор, 1 мкМ концентрации в средствах массовой информации) ^12.
3. Определить количество апоптоза в культуре, используя либо МРТ с ANX-Спио (описано в 3.4 ниже) или с помощью микроскопии после окраски TUNEL (APO-BrdUTM TUNEL Анализ Kit, Molecular Probes / Invitrogen, Eugene, OR) или после пятно ANX-FITC (Roche, Швейцария).
4. Назовите клетки с ANX-Спио (10 мг белка / мл среды, кроме как уже отмечалось), или эквивалентную массу свободного Спио (5 мг) в течение 15 мин при 37 ° C. Промыть 4 раза PBS, и наложения с 1 мл 1% агарозном для предотвращения распространения наночастиц Спио. Выполните МРТ блюда (см. ниже). Кроме того, мыть клетки и trypsinize после DOX и ANX-Спио маркировки, то позволяют клеткамформирование гранул в Эппендорф труб.

4. In Vitro МРТ

1. Используйте 1,5 или 3 Тесла GE Signa EXCITE сканер со стандартной катушки приемника колено для анализа лабораторных МРТ.
2. Место культуры блюда или трубы в агар призрак, и образ, используя градиент-эхо последовательность испорченный градиент: Время повторения (TR) 550 мс Время эхо (TE) 10 мс, флип угол 15 °, матрица 256 х 256, полевых из вида 3 см х 3 см, толщина среза 1,3 мм, количество средних (НИС) 2, расстояние 0 мм ^5. Изображение аксиально через слой клеток на пластине для T2 * потери сигнала, используя регионах интересов, (трансформирования) фиксированной области (например, 0,8 мм ^2). Установите для фона, используя контроль ROI сигнал от агара призрак. Измерение шума от сигнала окружающего воздуха призрак.
3. Рассчитать МРТ контраст к шум (CNR: [SI образец ROI-SI управление ROI] / [SD СИ фонового шума], где СИ интенсивность сигнала, аSD-стандартное отклонение) была рассчитана для каждой культуры блюдо.

5. Представитель Результаты

Измерение T2 * потери сигнала в пробирке требуются однородную призрак агар и отсутствие пузырьков воздуха, которые будут создавать артефакты сигнала недействительными. Этот артефакт трудно отличить от подлинных T2 * сигнал потери Спио и имеет решающее значение для интерпретации результатов. Пожалуйста, см. рисунок 1 для примера воздух артефакт, а также подлинные оксида железа T2 * потери сигнала.

Для изображений в пробирке блюдо культуры, применять соответствующий объем агар гель для каждой культуры блюдо, так что достаточной осевой МРТ ломтиками, которые примерно на 1 мм, может быть адекватно изображение всего блюда. На рисунке 2 показан ожидаемый сигнал МРТ из отдельных пластин культуры в агар. Существует правило, некоторые изменения сигнала на краях пластины, поэтому анализ регионов Interest должны избегать этих неровностей.

Рисунок 1. ANX-Спио обнаруживает апоптоза в культуре неонатальных кардиомиоцитов крысы. Рисунок 1А показывает фотографию гранулированный новорожденных кардиомиоцитов относиться с контрольным раствором (левая труба), ANX-Спио (средняя трубка), а DOX + ANX-Спио (правая труба) . Обратите внимание на коричневатый цвет DOX + ANX-Спио обработанных клеток, отражающих увеличился сохранение ANX-Спио соединения в апоптоз клеток. Рисунок 1B В пробирке изображений МРТ показывает интенсивный T2 * потери сигнала в DOX + ANX-Спио клеток. Кроме того, воздушные пузыри видно между ^4-й и ^5-й Эппендорф труб (маленькая черная пустота сигнала), который похож на сигнал пустоту ANX-Спио, и которые могут повлиять на анализ CNR.

Рисунок 2. ANX-Спиообязательным является специфическим для апоптоза клеток в культуре. Рисунок 2А показывает апоптоза кардиомиоцитов новорожденных крыс по культуре блюда, подвергаются либо ANX-FLUOS окрашивания или ANX-Спио окрашивания, с низкими и высокими концентрациями (слева и справа, соответственно) ANX-Спио. Обратите внимание на различные T2 * потери сигнала (черно-сигнал) апоптотических клеток, которые лечились с люминесцентными ANX (ANX-FLUOS) и низкий уровень по сравнению с высоким уровнем ANX-Спио. Увеличение T2 * потери сигнала на право связано с заметно снижается ANX-FLUOS сигнал, который конкурировал с более высокими ASX-Спио концентрации. Рисунок 2B иллюстрирует конкурентного связывания ANX-Спио против ANX-FLUOS сигнала и диссоциации постоянная, К _я. X-ось обозначает Аннексин концентрации белка в логарифмической шкале.

Фильм 1. Щелкните здесь для просмотра дополнительныхфильм.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Описанный метод сопряжения для связи Спио в Аннексин V использует боковой цепи аминогруппами Аннексин и карбоксильной фрагменты из наночастиц Спио. Через определенный окислительно-восстановительные шаги, ковалентная связь этих соединений может быть достигнуто, и в результате функци...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Catalogue #
Оксид железа суперпарамагнитных	Ocean Nanotech, Inc	ICK-40-005
Доксорубицин	Сигма	D1515-10 мг
СуперМаг сепаратор	Ocean Nanotech, Inc	N / A
Zetasizer Nano DLS машины	Малверн, Inc	N / A