Быстрое определение тепловых Ноцицептивная порога в диабетических крыс

Резюме

Здесь мы рассмотрим быстрый надежный и простой процедурой, чтобы определить самую низкую температуру, при которой крыс или мышей показывают nocifensive поведения, Т.е. Ноцицептивных тепловой порог (ТНТ). Этот метод применяется медленно растущих тепловых стимулов позволяет точную и воспроизводимую оценку ТНТ с минимальным, если таковые имеются, стресс для животных.

Аннотация

Болезненные диабетической нейропатии (PDN) характеризуется гипералгезии т.е. повышенная чувствительность к болевые раздражители, а аллодиния например, повышенная чувствительность к обычно безобидные раздражители ^1. Гипералгезии и аллодиния изучались в различных моделях грызунов больных сахарным диабетом ^2. Однако, как заявил Bölcskei и др., определение "боль" на животных моделях, является сложной задачей в связи с его субъективный характер ^3. Кроме того, традиционные методы используются для определения поведенческих реакций на вредное термические раздражители обычно не хватает воспроизводимости и фармакологическая ³ чувствительности. Например, с помощью горячей пластины методом Ankier ^4, вздрагивать, изъятие и / или лизать либо задних и / или передних лапах количественно, как рефлекс задержки при постоянной высокой тепловой раздражитель (52-55 ° С). Тем не менее, животные, которые hyperalgesic тепловой стимул не воспроизводимо показать различия в повторнойгибкого использования этих задержек выше пороговой температуры ^3,5. Как недавно описанный метод Bölcskei соавт. ⁶ процедур, описанных здесь, позволяет оперативно, чувствительной и воспроизводимое определение тепловых ноцицептивных пороги (ТНТ) у мышей и крыс. Метод использует медленно растущих тепловой раздражитель главным образом на кожу мышей / крыс подошвенной поверхности. Этот метод особенно чувствительны к изучению анти-ноцицепции в hyperalgesic государств, таких как PDN. Процедуры, описанные ниже, основаны на тех, опубликованной в деталях Almasi и др. ⁵ и Bölcskei и др. ^3. Процедуры, описанные здесь, были одобрены Уход лабораторных животных и использования комитета (LACUC), Государственный университет Райта.

протокол

ТНТ мышей и крыс, определяются с помощью дополнительных плитке обезболивания метр [iHPAM, МСДИ Инк науки о жизни (Woodland Hills, Калифорния)]. Оборудование состоит из нескольких компонентов: алюминиевая пластина (10 х 20 см) с системой отопления и под камерой наблюдения оргстекла выше; тепло управления устройства, программное обеспечение для сбора данных (МСДИ Part # Мягкая серия 8), ПК (персонального компьютер) и педаль для дистанционного пуска, остановки и сброса управления устройством. Система отопления позволяет запуск / остановка / перезагрузка процесса нагрева вручную с помощью клавиатуры на передней панели оборудования. IHPAM может быть установлен на различных скоростях нагрева, в режиме ожидания / отсечка температуры.

1. Подключение оборудования

1. Перед тестированием животных, осмотрите устройство для подтверждения выбранной скорости нагрева (например, 6 ° C / мин), начальный и конечный ожидания отключение температуры (например, 28 ° C и 55 ° C, соответственно).
2. Проверьте все соединения. Чтобы сохранить электронную копию результатов, аппарат должен быть подключен к компьютеру под управлением программного обеспечения серии 8. Кроме того, копии результатов могут быть распечатаны через последовательный порт устройства.
3. Тестирование оборудования. Нажмите на педаль один раз, чтобы убедиться, что программное обеспечение серии 8 записей данных: начальный ожидания, окончательная температура среза и времени в секундах, необходимое для достижения отсечения температуры.
4. В качестве еще одного тестового контроля, исследователи, участвующие в экспериментах, возможно, придется испытать прибор на себе. Снятие руку от металлической пластины в момент восприятия боли (46-48 ° C) не должны ни нанести вред коже и не производить любой последующий дискомфорт.
5. Когда устройство установлено и результаты шаги 1.3 и 1.4 записал их можно сравнивать. Это полезно для выявления потенциальных проблем, которые могут аннулировать использования устройства. Например, расхождения между первоначальной ожидания / окончательного отсечения темпеratures и фактического чтения аппарата, и / или различия между температурой отображается блок и фактическую температуру пластины, необходимые для стороны выхода.

2. Тестирование нормальных животных

Либо молодой или взрослый крыс Вистар [послеродовой (р) в возрасте 21-25 дней], или мышей (p21-25), любой генетический фон и пол могут быть использованы. У мышей, используемых в наших экспериментах, деформации C57BL/6J.

1. В ночь перед эксперименты должны быть выполнены, акклиматизироваться животных, помещая их клетки на скамейке, где iHPAM находится. За два часа до проведения испытаний, включите iHPAM ознакомиться с животными фонового шума прибора. На данный момент, iHPAM могут быть установлены и протестированы для проверки правильности функций (см. Шаг 1). Пища и вода предоставляется вволю на протяжении всего испытания, кроме случаев, когда животное находится в камере наблюдения (см. шаг 2.1).
   Примечание: Это импortant не предположить, что в лабораторных условиях в поведенческих опытах контролируется по умолчанию. Особое внимание следует обратить на генетических и экологических факторов, которые могут повлиять на результаты исследования поведения (см. обзор ^7).
2. Аккуратно установите нормальные мыши / крысы в ​​камере оргстекла наблюдение в верхней части нагревательного прибора. Дайте животному привыкнуть к нагретой поверхности (установлен на уровне 28 ° C), пока животное показывает удобные поведения.
   Примечание: В этих условиях нормальных крыс взрослых показывают начальный исследовательское поведение, иногда стоя на крышке камеры для наблюдений в то время как нюхают. Через несколько минут, крысы могут показать случайные приступы ухода и спокойной поведения. Иногда, крысы лежал расслабленный положение тела (лежа расширения), а случайно тычет носом в окрестностях. Нормальные мыши, как правило, более активны, чем крысы. Тем не менее, мышах показывают расслабленной исследовательское поведение через несколько минут яп наблюдения камеры. Это исключительно редкий наблюдать как избежать поведения (например, прыжки, пытаясь скрыться от наблюдения камеры) или оборонительные отношения (например, визг). Важно также отметить, что мыши могут взаимодействовать боль от одной мыши к другой ^8. Таким образом, это может быть важно, чтобы тест мышей помещают в отдельные клетки.
3. Место зеркала в задней части камеры наблюдения, чтобы позволить наблюдения на всех углах. Штатив проведения цифровой видеокамеры могут быть полезны для определения точного момента, когда nocifensive (боль избежать) поведения не было.
4. Как только животное удобно в жару наблюдения камеры на пластинки, нажав на педаль. Когда температура пластины нагревается в размере 6 ° C / мин, нормальных животных проявляют nocifensive поведения, связанного либо задние лапы * Обычно температура бушует от 46 до 48 ° C ^3,5,9,10. Таким образом, животное типичной формой удалить наблюдаемыхЦ И А Ц камеры примерно через 3 минуты.
   Примечание: Наблюдение за типичным nocifensive реакция есть крысы или мыши, задние лапы лизать, при встряхивании и / или подъема, достаточно, чтобы прекратить тепловой раздражитель. Это достигается путем нажатия на педаль. На данный момент, программа записывает температуру плиты и пластины сразу остывает до температуры ожидания (28 ° C) достигается (~ 0,5 мин). Эта температура, т. е. тот, который вызывает любая nocifensive реакция рассматривается как вредный порог тепла (ТНТ) нормального (контроля) животных.
   * Иногда, особенно у мышей, nocifensive поведение вредных температура может быть сначала наблюдалась в одной или обеих передних лап (например, лизать, сидя), за несколько секунд до задних лапах. Тем не менее, передние лапы лизать является нормальной составляющей ухода за поведение. Таким образом, только задние лапы реакции оцениваются. В случаях мышей может ухаживать за задние лапы, а также. Тем не менее, нормальный уход сделать п.OT последние более чем на несколько секунд, не требует интенсивного лизать и обычно заканчивается после очистки ее когтями.
5. Аккуратно удалите животное из пластины и поместите его в соответствующую клетку. Измерения тепла порог повторяется для другого элемента управления (нормальный) животных.
   Примечание: ТНТ может быть определен в одно животное с интервалом в 1-2 минут, не снимая животных со смотровой камере. TNT определения на крыс или мышей можно повторять несколько раз в течение нескольких дней. Это особенно полезно для определения среднего TNT отдельного животного, а также ее изменение с возрастом.
6. TNT животных контроль выражается как среднее из трех или более порогов ± SEM.
7. Статистический анализ полученных данных проводится сравнение различных групп лечения мышей и крыс. Параметрический процедур, включая дисперсионного анализа может быть надлежащим образом используются там, где данные распределены по нормальному закону, где лечение группы гомоskedastic, когда эти условия были выполнены следующие подходы могут быть применены. Дисперсионного анализа следует Ньюмена-Keuls тест для выявления различий в нескольких измерениях, т. е. многократного индивидуального ТНТ с / без лечения или в различные моменты времени (например, данные на рисунке 3). Парные Стьюдента-тест может быть использован для сравнения двух групп данных, т. е. до ТНТ против наркотиков после лечения; непарный т-тест может быть использован для определения различий в изменении TNT с наркотиками, лечение против автомобиль обработанных животных (например, , данные на рисунке 4).

3. Тестирование диабетических животных

Стрептозотоцина (СТЗ) вызванной диабетической крысы наиболее часто используемых животных моделей для изучения механизмов ПДН и оценки анальгетиков и лечения ^11,12. Крысы сделали диабетической одной внутрибрюшинного дозу СТЗ (60 мг / кг) может бэлектронной испытания тепловых гипералгезии в ^3-й неделе после начала сахарного диабета ^11. Важно отметить, что не все крысы диабетической развивать PDN. Тем не менее, животные, у которых развитие гипералгезии (~ 50%) может быть легко идентифицирован. Действительно, их ТНТ ниже, чем обычно *.

* Чтобы определить ТНТ в СТЗ-диабетических крыс, начиная пластины при температуре 15 ° C вместо 28 ° C используется. Причиной этих изменений является то, что большинство диабетических животных с ПДН, как ожидается, hyperalgesic ^2,11. Таким образом, они будут иметь более низкий, чем обычно вредные пороги тепла (например, <45 ° C).

1. Диабетических крыс помещают в камеры наблюдения на начало тестирования аппарата. Животных допускается, чтобы акклиматизироваться к поверхности пластины, пока животное показывает удобное поведение.
   Примечание: Как правило, диабетической крысы не показывают большую часть нормального поведения. Диабетическая крысы, как правило, hypoactive, вялыми, часто показываетограниченного движения и медленно ухода. Редко можно наблюдать таблице на крышке камеры наблюдения. Через несколько минут, диабетических крыс может спокойно оставаться в углу камеры со случайным нюхать окрестностей.
2. После того, диабетическая животное комфортно в камере наблюдения, пластина нагревается, как в шаге 2.3 диабетической крысы могут проявлять nocifensive поведения, связанного либо задних / передних лап. Обычно это происходит в не-вредных пластины температурах (например, <45 ° C), или не более чем через 5 минут в камере с 6 ° C / мин повышение температуры.
   Примечание: nocifensive реакция молодых крыс диабетической взрослых не отличаются от нормальных крыс. Тем не менее, низкая температура вызывающих такое поведение значительно снижена.
3. См. шаг 2,4
4. Среднее более трех порогов в день эксперимента в виде ° C ± SEM считается вредных порог тепла diabetiс животными.
   Примечание: аналогичные парадигмы к тому, объяснил для нормальных и диабетических крыс можно проследить, чтобы определить тепловой анти-nocifensive влияние анальгетиков на тепловых порогов.

4. Тестирование Обезболивание

Анти-ноцицептивной свойства препаратов (например, анальгетики), а также определения фармакологической такие параметры, как минимальная эффективная доза может быть легко получены с помощью шагов описано выше. Он предсказал, что надлежащее дозы обезболивающего крысам / мышей значительно повысит их ТНТ. Это особенно чувствительны животные с термической гипералгезии ^3. Однако, чтобы избежать предвзятости в интерпретации результатов, исследователи, участвующие в наблюдения за поведением животного группы не должны знать, или знать, если животных лечили или нет. Кроме того, препараты для инъекций наблюдателя может быть получен другой следователь и маркированыA, B, C и т.д. Дозировка осуществляется в распечатке, с указанием индивидуальных доз определены в животное.

В зависимости от тестируемый препарат, различные дозы обезболивающего потенциал может быть введена в нормальное или диабетический животных 5-15 мин до поведенческих тестов. Правильное управление должно быть включено (т.е. соответствующего возраста животных, которым вводили только транспортное средство и / или диабетических крыс без PDN) и протестированы с использованием одинаковых условиях (например, той же начальной температуре пластины). Хронические эффекты препаратов могут быть проверены, а также.

5. Представитель Результаты

Самая низкая температура пластины вызывающие nocifensive реакции либо задние лапы молодых взрослых обычную крыс или мышей были определены следующие шаги 2-1 до 2-6. Как показано на рисунке 1, TNT нормальных молодых крыс и взрослых мышей были 47,2 ± 0,2 ° C и 47,5 ± 0,5 ° C, соответственно.

У нас есть OBSErved ни значительный суточный ход ТНТ человека (рис. 2A), ни значительных изменений ТНТ среди людей того же возраста (рис. 2В). TNT различия, связанные с гендерным не наблюдается (не показано).

ТНТ молодых взрослых СТЗ-диабетических крыс были определены таким же образом, как и для нормальных крыс (шаги 3.1 до 3.3). Тем не менее, температура начала пластины был установлен на 15 ° C вместо 28 ° C. Nocifensive поведение СТЗ-диабетических крыс оценивали по крайней мере три раза в индивидуальных и в повседневной моды, начиная одиннадцать дней после инъекции СТЗ. Как показано на рисунке 3, значительное снижение (р <0,01) тротила СТЗ-диабетических крыс становится очевидным, через две недели после инъекции СТЗ. Средний тротила СТЗ-диабетических крыс составила 45,6 ± 0,1 ° С (п = 16, объединенных значений 14-23 дней).

Диабетическая крыс выставки значительно ниже, чем нормативный TNTл считались у PDN. Эти крысы были использованы для проверки острый анти-ноцицептивной свойствами анальгетика (соединение). ТНТ были определены в нормальных и диабетических крыс вводили либо разовая доза соединения или транспортного средства, только за пять минут до теста. Как показано на рисунке 4, одну внутри-перитонеального дозы соединения значительно увеличили ТНТ диабетических крыс по сравнению с крыс, получавших один автомобиль (45,6 ° C против 47,6 ° C, соответственно). Анти-nocifensive эффект соединения наблюдалось также в нормальных крыс, хотя значимыми (р <0,01), это было менее выраженным (47,4 ° C против 48,0 ° C, соответственно).

Рисунок 1. Определение ТНТ нормальных молодых крыс или мышей взрослых: ТНТ молодых крыс взрослых (p21-24) или мышей (p20-21) были проверены в iHPAM следующие шаги, описанные абове. В общей сложности 12 крыс и 25 мышей были протестированы. Измерения проводились в течение нескольких дней, и результаты были объединены. Результаты представлены в виде среднего ± SEM. Минимальные и максимальные значения TNT, записанные в этих крыс 46.2 ° C и 48,6 ° С соответственно. В случае с мышами, максимальное и минимальное значения TNT были записаны 48,8 ° C и 44,9 ° C, соответственно.

Рисунок 2. Возрастная зависимость ТНТ у крыс и мышей), построенных являются ТНТ четыре нормальных крыс (п ​​= 4) от 21-дневного возраста определяется по крайней мере три раза в день в течение 5 дней B) ТНТ мышей Однопометники определяется один раз в указанный. возрастов. Цифры в верхней части каждого определения точки представляет собой количество помета используется.

Рисунок 3. Диабетическая крысы стали hyperalgesic 3Экс после начала сахарного диабета: ТНТ шести (п = 6) соответствует возрасту молодые взрослые СТЗ-диабетических крыс определяли каждый день, начиная за 11 дней после индукции диабета. Показаны среднесуточные TNT (среднее ± SEM). Диабетическая ТНТ определяется между 11-13 дней после инъекции СТЗ были в пределах нормы (красная линия). Через две недели после инъекции ТНТ СТЗ значительно снизился до 45,1 ± 0,4 ° C, (р <0,05).

Рисунок 4. Острый анти-nocifensive эффектов соединения B в СТЗ-диабетических крыс. Молодых взрослых нормальных крыс (синяя группа п = 12) и возраста СТЗ-диабетическая hyperalgesic крыс (зеленая группа п = 6) были проверены в iHPAM после внутрибрюшинного введения транспортного средства (темные полосы) или составной (свет баров). Средний TNT ± SEM для каждой обработки (контроль транспортного средства или соединения обработанных) показаны. Звездочки означают статистическое различие(Р <0,05).

Обсуждение

Как и в классическом горячей пластины теста количественно тепловой гипералгезии ^4,13, анализ ноцицепции описанный здесь позволяет быстрый и надежный способ количественной nocifensive поведение у крыс и мышей. Однако, в отличие от классического теста, дополнительные горячие пластины м?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Имя	Компания	Номер по каталогу
Инкрементное горячей плиты Обезболивание метр	СИТИ Инк науки о жизни	Part # PE34
Мягкая Серия 8	СИТИ Инк науки о жизни	Part # Series8
Стрептозотоцин	Calbiochem	572201