JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Амперометрического Техника меры высвобождение дофамина из одной клетки путем определения окислительной ток, создаваемый спонтанной окисления дофамина. Одновременное зажим напряжения и амперометрии методологии выявления механистической взаимосвязи между общим «деятельность» переносчика дофамина и регулирующей роли этой деятельности на обратный транспорт дофамина.

Аннотация

После его выхода в синаптическую щель, допамин оказывает своим биологическим свойствам через своих пред-и пост-синаптические цели 1. Дофамина сигнал прекращается путем диффузии 2-3, внеклеточных ферментов 4, и мембраны перевозчики 5. Переносчика дофамина, расположенных в пригородных синаптическую щель дофаминовых нейронов очищает выпустила аминов через внутренний поток дофамина (поглощение). Переносчика дофамина может работать и в обратном направлении, чтобы освободить аминов изнутри наружу в процессе, называемом внешним транспортом или истечение допамин 5. . Более 20 лет назад Sulzer и др. сообщили переносчика дофамина может работать в двух режимах деятельности: вперед (поглощение) и обратный (отток) 5. Нейромедиатора выпущен через истечение через транспортер может перемещать большое количество допамина в межклеточное пространство, и было показано, играют важную регулирующую роль в внеклеточный дофамин чomeostasis 6. Здесь мы расскажем, как одновременный зажим патч и амперометрии запись может быть использована для измерения выпущен допамина через отток механизм с временным разрешением миллисекунду, когда мембранный потенциал находится под контролем. Для этого цельноклеточной текущих и окислительного (амперометрического) сигналы измеряются одновременно, используя Axopatch 200B усилителя (Molecular Devices, с низкочастотный фильтр Бесселя набор на 1000 Гц для целой клетки текущей записи). Для амперометрии записи электрод из углеродного волокна подключен к второму усилителю (Axopatch 200B) и находится рядом с плазматической мембраной и выдерживают при +700 мВ. Целых клеток и окислительный (амперометрического) токи могут быть записаны и вольт-амперные отношения могут быть получены с использованием протокола напряжения шага. В отличие от обычных амперометрических калибровки, которая требует преобразования в концентрации, ток сообщил напрямую, без рассмотрения в силу 7 объеме. Таким образом, полученные данныепредставляют собой нижний предел дофамина истечения потому, что некоторые передатчика теряется в объеме раствора.

протокол

1. Оборудование и материалы

  1. Установите клетку Фарадея в верхней части таблицы анти вибрации (TMI), чтобы уменьшить фоновый шум.
  2. Одновременное патч зажим амперометрии записи системы требуется инвертированный микроскоп с превосходной оптикой и DIC большим рабочим расстоянием объектива. Подключите микроскоп маяком для автомобильного аккумулятора. Этот источник постоянного света для системы будет способствовать дальнейшему снижению электрических помех.
  3. Гидравлические микроманипуляторами (Siskiyou) дальнейшего снижения шума. В нашей конфигурации мы используем правую руку манипулятора для всей записи ячейки, а левши для амперометрии.

2. Подготовка электродов для записи

  1. Потяните патч электродов при использовании кварцевых пипетки на P-2000 съемник (Саттер). Наша тяга длится около 5 сек, с двумя циклами тепла. Это тепло временем привело к последовательным сопротивлением (3-4 МОм) во всей нашей патч пипетки клетки.
  2. Заполнить электрод спипетки раствор, содержащий 2 мМ дофамина и смонтировать его на правый манипулятор. Оберните контейнер с пипеткой раствор, содержащий DA с алюминиевой фольгой. Держите на льду. Допамин является окисляемых. Ведение решения на льду, защищенном от света уменьшится скорость окисления дофамина.
  3. Аккуратно удалите ProCFE (Даган), низкий уровень шума углеродного волокна амперометрического электрода с ящиком, заполнить ртутью, крепление на амперометрического адаптера (как показано на рисунке 1), а затем установите на право maniupulator. Защита кончика углеродного волокна от повреждения путем проведения дальнем конце углеродного волокна. Проверьте электрод с лабораторией микроскоп, чтобы обеспечить кончик чистым и неповрежденным.
  4. Проверьте целостность амперометрического электрода, поставив электроды в стеклянной нижней чашке Петри содержащие внешние решения. Запись базовый ток в отсутствие дофамина. Добавить 10 мкл раствора 1 мМ DA к блюду. Хороший амперометрического повторного электродаШнуры увеличение окислительного тока. Повторите этот шаг в начале и в конце каждого эксперимента, чтобы убедиться, амперометрического электрода работает должным образом.

3. Подготовка первичных нейронов культуры дофамин нейроны или клетки инженерии с целью экспрессии переносчика дофамина в стеклянным дном чашки Петри

  1. Осторожно промыть клеток или нейронов допамина в три раза теплой внешним решением.
  2. Установите стеклянным дном чашки Петри на столик микроскопа.

4. Визуализируйте сотовый и выполнить эксперимент

  1. Найти правильный фокус четко визуализировать клетки. Поместите положительное давление на патч электрода. Затем, осторожно довести оба электрода вниз в раствор, и близко к клетке.
  2. Установите амперометрических электродов рядом с клеткой (на левой стороне), и патч электрода справа.
  3. Достичь гигаом печать на клетке с патчем электрода. Разрыв печать с всасываниядостижения всей конфигурации ячейки.
  4. Разрешить 5-8 мин для диализа внутренних раствор, содержащий дофамин в клетку.
  5. Используйте требуемое напряжение шага или рампы протокол. Одновременно получать данные как из пипетки патч и амперометрического электрода для измерения токов целые клетки и обратного транспорта дофамина через переносчика дофамина в то время как мембранный потенциал контролируется через патч пипетки.

Результаты

Комбинированный зажим патч с амперометрии может измерить потенциал-зависимых DAT-опосредованной DA оттока. Рисунок 2А показывает, представитель экспериментальной конфигурации и записи DAT-опосредованной DA отток, когда внутриклеточный среды и мембранный потенциал зажаты цельно...

Обсуждение

Одновременное напряжение зажим и амперометрии имеет следующие преимущества. Все типы клеток, которые доступны и могут быть использованы для записи. Идентификация клеток или нейронов, где записи делаются просто и понятно. В частности, если ячейка флуоресцентно меченые, добавив флуорес...

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Мы благодарим доктора Sanika Чирва для критического обзора этой рукописи. Эта работа была поддержана Национальным институтом здоровья (DA026947, DA021471, и NS071122).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Оборудование
Антивибрационные таблице ж / клетка Фарадея Технические Manufacturing Corporation 63-500 серии мы используем модель 63-543
Инвертированный микроскоп Nikon TE-2000 Nikon прекращенный Теперь Eclipse Ti
Два малошумящих усилителей Axopatch 200b Molecular Devices 800-635-5577
1-CV 203 BU headstage Molecular Devices 800-635-5578
1-HL-U пипетки держателю Molecular Devices 800-635-5579
Digidata 1440A / D конвертер Molecular Devices 800-635-5580
Два манипулятора Siskyou, слеваи правой рукой Siskiyou MX6600R MX6600L 877-313-6418
Лазерная пипетки съемника Sutter Instruments P-2000 888-883-0128
Низкий уровень шума углеродного волокна амперометрического электрода ProCFE www.dagan.com
Низкий уровень шума кварца пипетки Sutter Instruments QF100-70-7.5 888-883-0128
12-вольтовый автомобильный аккумулятор широко доступными
Автомобильное зарядное устройство широко доступными
Реагент
Хлорид натрия (NaCl) Сигма S7653
HEPES Сигма H3375
Декстроза Сигма G7528
Сульфат магния (MgSO 4) Сигма M2643
Фосфат калия однозамещенный (KH 2 PO 4) Сигма P5655
Хлорид калия (KCl) Сигма P9333
Хлорид кальция дигидрат (CaCl 2 • 2H 2 0) Сигма 223506
Хлорид магния гексагидрат (MgCl 2 • 6H 2 0) Сигма M2670
EGTA Сигма E0396

Ссылки

  1. Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation. Brain Res. 421, 325-335 (1987).
  2. Gonon, F. Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo. J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).
  3. Sulzer, D., Pothos, E. N. Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms. Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).
  4. Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission. J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).
  5. Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons. J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).
  6. Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).
  7. Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).
  8. Goodwin, J. S., et al. Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in. , 284-2978 (2009).
  9. Kahlig, K. M., et al. Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).
  10. Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus. PLoS One. 5, e11382 (2010).
  11. Gnegy, M. E., et al. Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter. Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Neuroscience69In VitroPatch ClampEfflux

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены