Определение количества клеток млекопитающих, размер ячейки и клеточной здравоохранения на основе использования Moxi Z Мини Автоматизированная Сотовые Счетчик

Резюме

Moxi Z миниатюрный автоматизированный счетчик клеток является новым инструментом, который сочетает в себе принцип Coulter с запатентованной тонкопленочной технологии датчика и собственный алгоритм, программное обеспечение для выполнения калибровки и подсчета широкий диапазон размеров частиц, а также для определения общего состояния здоровья монодисперсных культур клеток млекопитающих. Этот протокол описывает использование этого инструмента для подсчета и оценки здоровья клеточных культурах.

Аннотация

Particle and cell counting is used for a variety of applications including routine cell culture, hematological analysis, and industrial controls^1-5. A critical breakthrough in cell/particle counting technologies was the development of the Coulter technique by Wallace Coulter over 50 years ago. The technique involves the application of an electric field across a micron-sized aperture and hydrodynamically focusing single particles through the aperture. The resulting occlusion of the aperture by the particles yields a measurable change in electric impedance that can be directly and precisely correlated to cell size/volume. The recognition of the approach as the benchmark in cell/particle counting stems from the extraordinary precision and accuracy of its particle sizing and counts, particularly as compared to manual and imaging based technologies (accuracies on the order of 98% for Coulter counters versus 75-80% for manual and vision-based systems). This can be attributed to the fact that, unlike imaging-based approaches to cell counting, the Coulter Technique makes a true three-dimensional (3-D) measurement of cells/particles which dramatically reduces count interference from debris and clustering by calculating precise volumetric information about the cells/particles. Overall this provides a means for enumerating and sizing cells in a more accurate, less tedious, less time-consuming, and less subjective means than other counting techniques⁶.

Despite the prominence of the Coulter technique in cell counting, its widespread use in routine biological studies has been prohibitive due to the cost and size of traditional instruments. Although a less expensive Coulter-based instrument has been produced, it has limitations as compared to its more expensive counterparts in the correction for "coincidence events" in which two or more cells pass through the aperture and are measured simultaneously. Another limitation with existing Coulter technologies is the lack of metrics on the overall health of cell samples. Consequently, additional techniques must often be used in conjunction with Coulter counting to assess cell viability. This extends experimental setup time and cost since the traditional methods of viability assessment require cell staining and/or use of expensive and cumbersome equipment such as a flow cytometer.

The Moxi Z mini automated cell counter, described here, is an ultra-small benchtop instrument that combines the accuracy of the Coulter Principle with a thin-film sensor technology to enable precise sizing and counting of particles ranging from 3-25 microns, depending on the cell counting cassette used. The M type cassette can be used to count particles from with average diameters of 4 - 25 microns (dynamic range 2 - 34 microns), and the Type S cassette can be used to count particles with and average diameter of 3 - 20 microns (dynamic range 2 - 26 microns). Since the system uses a volumetric measurement method, the 4-25 microns corresponds to a cell volume range of 34 - 8,180 fL and the 3 - 20 microns corresponds to a cell volume range of 14 - 4200 fL, which is relevant when non-spherical particles are being measured. To perform mammalian cell counts using the Moxi Z, the cells to be counted are first diluted with ORFLO or similar diluent. A cell counting cassette is inserted into the instrument, and the sample is loaded into the port of the cassette. Thousands of cells are pulled, single-file through a "Cell Sensing Zone" (CSZ) in the thin-film membrane over 8-15 seconds. Following the run, the instrument uses proprietary curve-fitting in conjunction with a proprietary software algorithm to provide coincidence event correction along with an assessment of overall culture health by determining the ratio of the number of cells in the population of interest to the total number of particles. The total particle counts include shrunken and broken down dead cells, as well as other debris and contaminants. The results are presented in histogram format with an automatic curve fit, with gates that can be adjusted manually as needed.

Ultimately, the Moxi Z enables counting with a precision and accuracy comparable to a Coulter Z2, the current gold standard, while providing additional culture health information. Furthermore it achieves these results in less time, with a smaller footprint, with significantly easier operation and maintenance, and at a fraction of the cost of comparable technologies.

протокол

1. Подготовка образцов

1. Развести клеточной суспензии с ORFLO разбавителем или соответствующего растворителя, так что концентрация клеток в пределах рабочего диапазона прибора (от 3000 до 500000 клеток / мл для кассеты типа M, или от 3000 до 2500000 кл / мл для кассеты типа S).
2. Разведении 1:5 до 1:20 (Type M кассеты) или нет разбавления до 1:5 разбавление (кассета типа S) рекомендуется для большинства клеточных линий млекопитающих, но и соответствующего разбавления будет зависеть от типа клеток и повышения плотности посева. Объем, необходимый для точного подсчета примерно 75 мкл.

2. Запуск Образцы

1. Поверните Moxi Z, нажав на кнопку питания, и на главном экране будет отображаться.
2. Нажмите на поднос и вставить кассету в Moxi Z. Пример Внесите 75μL ... экране будет отображаться.
3. Пипеткой 75 мкл образца в порту заполнения кассет (синий овалс номером 1 или 2, в зависимости от окончания кассета вставляется в прибор). Эти одноразовые кассеты, которые могут быть использованы для 2 испытаний. Примечание: Место пипетки непосредственно на загрузку и на ~ 45 градусов так, чтобы кончик пойман под передним краем ямы. Когда отпуск, важно, что вакуум не "опередить" по отправлению жидкости, может привести карманы воздуха, чтобы войти в кассете. Рекомендуется иметь небольшой шарик (размером вступления хорошо) жидкости форма над колодцем во время отпуска.
4. Для подсчета большинство клеток млекопитающих, прикоснуться к экрану в любом месте для начала. За счет очень мелких частиц (от 4 до 8 мкм среднего диаметра для типа М и 3-8 мкм среднего диаметра для Type S), Moxi Z может работать в режиме малых частиц. Примечание: кассетного типа указывается в черную полосу в верхней части экрана. В этом режиме Moxi Z определяет диаметр шкале от 2 до 10 мкм по умолчанию и выполняет количества ипеть оптимизированными параметрами для обнаружения мелких клеток. Нажмите здесь касаться малого кнопку Mode частиц (черный квадрат), чтобы начать испытание и запустить в этом режиме.
5. Moxi Z начнутся испытания и результаты клеток будет завершена примерно за 8 секунд (кассетного типа М) или 15 секунд (кассета типа S).
6. Установка кривой и MVI расчетов начнется автоматически и требует всего лишь несколько дополнительных секунд. Когда подходящий подходит найден, то результаты будут автоматически отображаться на экране.
7. Для того, чтобы Память режим по умолчанию приобретение, нажмите Установить Кривая графа для переключения в режим Память.
8. В этот момент кассета может быть удалено из устройства.

3. Управление данными

1. Если автоматическом масштабировании выключен, результаты первоначально отображается количество кривая посадка на диаметр масштабе 2-34 мкм (Type M кассеты) или 2-26 μм (кассета типа S). Если автоматическом масштабировании, затем Moxi Z будет автоматически масштабироваться по горизонтальной оси (оси Х) в диапазоне, который находится ближе всего к ширине кривой трудоспособного населения, обеспечивая при этом все кривая согласия отображения данных.
2. Если автоматическом масштабирование выключено, чтобы вручную отобразить результаты в более высоком разрешении, нажмите 2-26 мкм значок (типа М) или 2-18 мкм значок (тип S). Примечание: кассетного типа указывается в синем поле в левом верхнем углу экрана. Это рекомендуется при подсчете меньше клеток или частиц улучшить построения кривой возможностей, а также возможность пользователей визуально различать нюансы данных.
3. При увеличении разрешения экрана по горизонтали, масштабирование кнопки динамически настраивать, чтобы на велосипеде между доступными ось х диапазонах: 2-34, 2-26, 2-18, и 2-10 мкм для кассеты типа M, или 2 26, 2-18, и 2-10 мкм для кассеты типа S. Эта функция доступна только availablé сразу после подсчета клеток.
4. Граф информации (клеток / мл) для кривой согласия или закрытого региона отображается в черном ящике под левой части гистограммы. Средний размер ячейки информация отображается в черном ящике под правой части гистограммы.
5. Значение MVI отображается синее поле в верхнем правом углу гистограммы. Если тест был запущен в режиме небольшой частицей, MVI не применяется, и будет отображаться как "MVI = РП". Кроме того, если концентрация клеток находится за пределами диапазона MVI операционной сообщение "MVI = вне диапазона" будет отображаться.
6. Для сохранения текущей гистограммы, нажмите Готово значок. Это сохраняет данные с именем "Test XXX", где XXX является соответствующее количество тестов.
7. Чтобы вручную ворота гистограмма, нажмите для переключения количества Кривая Fit результаты кнопку. Это делает Память режим по умолчанию приобретения. Затем сдвиньте каждый синий маркер стробирования для установки ворот, или нажмите гоэлектронной стрелки влево и вправо (они появляются при прикосновении синий маркер стробирования) для точной настройки ворота только клетки между маркерами учитываются. Гистограмма вертикальная шкала автоматически масштабируется на основе кривой трудоспособного населения амплитуды. Чтобы изменить это вертикальная шкала, проведите экран вверх или вниз на гистограмме региона.
8. Нажмите воротами графа результатов для возврата дисплея в режиме кривая форме и сделать кривую подходит режим по умолчанию режим приобретения.
9. Затем нажмите кнопку Готово значок, чтобы сохранить результаты и вернуться к главному экрану. Чтобы удалить результаты, нажмите кнопку Удалить значок в любое время удалить результаты теста.

4. Анализ ранее полученных данных

1. Чтобы открыть сохраненный тест, нажмите на значок гистограммы на главном экране.
2. Иконы до девяти сохранили гистограммы будет отображаться на экране.Нажмите на соответствующую иконку на тест интересов или нажмите на страницу или Page Down иконки, чтобы узнать больше результатов тестов.
3. Каждая гистограмма будет открыта либо в графу Кривой режим Fit или воротами режим графа, в зависимости от того, как она была спасена. В закрытом режиме граф, стробирование маркеры могут быть установлены по желанию скользящий каждый синий маркер стробирования самостоятельно. Авто ворота, коснувшись от желаемого пика. Нажмите для переключения между воротами и графа кривая режима Fit графа.
4. Нажмите кнопку Масштаб и Unzoom иконки для настройки вертикальной шкалы гистограммы. Вертикальная шкала может быть изменена вертикально отпечатков пальцев на дисплее вверх (увеличение) или вниз (для уменьшения).
5. Нажмите кнопку Удалить, чтобы удалить результаты теста.
6. Нажмите Готово значокзакрыть результатов испытаний и вернуться к главному экрану. (Примечание: увеличенное зрения не будут сохранены.)

5. Передача данных на ПК

1. Данные могут быть переданы на компьютер с помощью приложения Orflo Moxichart или через передачу USB, подключив Moxi Z USB кабель к ПК или Mac. Для передачи Bluetooth (MoxiChart), в первую очередь определить Bluetooth ID устройства, нажав на значок Bluetooth на главном экране устройства Moxi Z.
2. На компьютере, откройте MoxiChart приложения и нажмите на значок Bluetooth в правом верхнем углу. Затем выберите устройство, которое соответствует Bluetooth идентификатор Moxi Z и выбрать папку для загружаемых файлов.
3. Moxichart автоматически перенести все файлы в указанной директории через Bluetooth соединение.
4. Файлы передаются по Bluetooth (MoxiChart) или USB могут быть открыты и анализузет непосредственно с MoxiChart заявки или, потому что они отформатированы. CSV файлов, они могут быть напрямую открыт в Microsoft Excel или другие программы для анализа данных дополнительно / пользовательские анализа.

6. Представитель Результаты

Для оценки точности и достоверности Moxi Z, подсчет НЕК-293 клеток HeLa клеток CHO-K1, дрожжи, Jurkat E6-1 клеток, клеток PC12, и точность калиброванного шарика суспензии с концентрацией от 0-500,000 клеток / мл (Type M кассета) и 0-2-2.5e ^{6 кл} / мл (кассета типа S) подсчитывали и сравнивали с использованием Coulter Z2 и Moxi Z. Все клетки млекопитающих были получены из Американской коллекции типовых культур (АТСС) и культурным, как описано выше ^7-11. Короче говоря, клетки культивировали в суспензии в 75 мм ² культуре ткани колбы с основными средствами массовой информации RPMI 1640 (Jurkat E6-1, PC12), MEM (НЕК-293, HeLa) клеток, или F12K (СНО-К1) клеток. Все средства массовой информации было дополнено10% эмбриональной телячьей сыворотки и 100 U penicillin/100 мкг стрептомицина. Колбы были сохранены в инкубаторе при температуре 37 ° C с 5% CO _2. Клетки пассировали каждые 3 дня. Дрожжевые клетки (X5, C. Albicans, Vin 13) были переданы и использованы непосредственно, как это предусмотрено. Начальная концентрация образца ~ 500 000 клеток / мл для типа M кассеты данные и ~ 2-2.5e ^{6 кл} / мл для кассеты типа S были созданы использованием Coulter Z2. Последующие теоретические уровни концентрации были подготовлены на основе серийных разведений с физиологическими буферов (ISOTON II и сбалансированный солевой раствор Хэнка). На каждой концентрации, идентичных образцов были измерены в обеих системах и заговор против друг друга. Как видно на рисунке 2, была сильная линейная корреляция (Type M R ^2> 0,9886, Type S R ^2> 0,9781) между счетчики для всех образцов. Концентрации также по сравнению с ожидаемой / теоретической клетке концентрации и с Moxi Z и Z2 ( Рисунок 3) и вновь продемонстрировал сильный линейных корреляций (типа М т ^2> 0,9758, Type S R ^2> 0,9774).

Для оценки точности, НЕК-293 и рассчитывает HeLa клетки проводились с использованием Coulter Z2, Moxi Z, и гемоцитометра. Средний коэффициент вариации (CV, п = 19) клеток помощью Moxi Z (Type M кассета), Coulter Z2 и гемоцитометра были рассчитаны с CV она измеряется от 5 отдельных импульсов в 200,000-300,000 клеток / мл. Малый средний CV (рис. 4) Moxi Z является сравнимой с Z2 и представитель высокой точностью достижимо только с Coulter на основе подсчета технологий.

Калибровка точности прибора Moxi Z был оценен следующий через измерении купил, точность калиброванной бисера полистирола. Усредненный размер частиц измерений (п = 5) из Moxi Z построены на производитель сообщил размеров. Как видно яп. На рисунке 5, Moxi Z измерения последовательно соответствовали производитель значения с высокой линейной корреляции (R ² = 0,9989).

Помимо размера и количества информации, Moxi Z предоставляет безреагентных, общая оценка здоровья млекопитающих культуре клеток с сообщалось Moxi Жизнеспособность Index (МВИ) значение. Этот показатель формируется из соотношения количества клеток в популяции интерес по отношению к общей рассчитывает частиц. Чтобы продемонстрировать возможности MVI измерений, показания MVI (Type M кассета), были по сравнению со стандартной ручной и проточной цитометрии живой / мертвый методов измерения. Популяции мертвых (<10% жизнеспособных) НЕК-293 и HeLa клетки были созданы через ночь инкубации живых клеток в питательной свободной, фторид натрия содержащие растворитель (ISOTON II, Beckman Coulter) при 37 ° C. Контролируемые теоретический уровень жизнеспособности были подготовлены ratiometrically смешивания известной концентрацией живых и мертвых клеток. Resulting решения были проанализированы на предмет жизнеспособности уровней в двух экземплярах и с гемоцитометра подсчет и измерения потока цитометр. Гемоцитометра измерения были сделаны с использованием традиционных 50/50 смесь 0,1% Трипановый синий раствор и клеток. Измерения проточной цитометрии были сделаны с использованием Guava PCA цитометр (Merck) с использованием реагентов и Viacount производителя указан протокол (Merck). Как показано на рисунке 6, коэффициент корреляции Пирсона значения (R ²⁾ "линейной подгонки данных MVI аналогичным гемоцитометра жизнеспособность проценты за" НЕК клетки HeLa и клетки R ² = 0,9937 и R ² = 0,9728, соответственно. Эти результаты показывают, что этот подход обеспечивает информационную культуру здоровья в широком спектре клеточных viabilities, что выгодно для живой / мертвый измерений, полученных с помощью проточного цитометра или гемоцитометра.

Таблицы и рисунки (от Dittami и др., 2011). ^15:

Рисунок 1. Тонкие пленки Coulter подсчет: Электрический ток проходит через сотовый зону обнаружения тонкой пленки кассеты. Как клетки течь один файл через CSZ, мгновенное увеличение напряжения измеряются Moxi Z.

Рисунок 2. Moxi Z рассчитывает сопоставимы с Coulter Z2 имеет значение. Идентичные подсчет клеток и шарик суспензии были подсчитаны с использованием как Coulter Z2 и Moxi З. Усредненные значения счетчика (п = 3-4) в Moxi рассчитывает Z построены по отношению к Coulter соответствующие Z2 графов и R ² значения линейной аппроксимацией были определены. А) типа М кассеты - концентрация диапазоне 0 - 500 000 клеток / мл. B) кассеты типа S - концентрация диапазоне 0 - 2-2.5e ⁶ / ml.Error бары показывают, ± 1 стандартное отклонение.

Рисунок 3. Moxi измерения концентрации Z против теоретической концентрации клеток. А) типа М кассеты - теоретические значения концентрации были получены из серийных разведений начальной 500000 клеток / мл образец B) кассеты типа S -. Теоретические значения концентраций были приготовлены из серийных разведений первых 2 - 2.5e ^{6 кл} / мл образца. Ошибка бары указывают на ± 1 стандартное отклонение.

Рисунок 4. Коэффициент вариации для Coulter Z2, Moxi Z (Type M кассета), а гемоцитометра. Средний коэффициент вариации (CV, п = 19) НЕК-293 и рассчитывает HeLa клетки для каждого подхода были рассчитаны с резюме измеряется от 5 отдельных подсчет НЕК-293 и HeLa клетки в 200 000 - 300 000 клеток / мл. Ошибка бары указывают на ± 1 стандартное отклонение.

Рисунок 5. Точность размеров частиц измерений с помощью Moxi Z-Z Moxi измеряется размер гранул (кассета типа М) против производителя сообщила размер гранул. Ошибка бары указывают на ± 1 стандартное отклонение.

Рисунок 6. Культура Здоровье оценка использования MVI - Сравнение измерений МВИ (кассетного типа M) и гуавы СПС Viacount жизнеспособности по сравнению с визуальным, трипанового-синих окрашенных рассчитывает жизнеспособность помощью гемоцитометра.

Обсуждение

Лежащей в основе реализации подхода Coulter может быть очень детерминированным общей точности измерений. Важной областью является коррекция сырья количества клеток для "совпадение событий", когда два или несколько ячеек одновременно проходят через диафрагму и измеряется как единый электрический события. "Совпадение событий" вклад в ошибку, которая варьируется в зависимости от ряда факторов, включая размер ячейки и степень кластеризации (Davis и др., 1967) ^6. В результате, необходимую коррекцию совпадение для данного образца не может быть предсказано, варьируя в широких пределах клеток / частиц типа и даже между различными культурами одинаковых типов клеток. Созданная теория уходит корнями в начальной публикации Coulter, включает в себя применение логарифмической регулировки сырья рассчитывает в зависимости от количества наблюдаемых событий и эмпирически определенной, конкретной частицы поправочный коэффициент, г. Хотя точный подсчет может быть должным образом достигается при тего коррекции алгоритма, она ограничена в своей практической применимости в связи с большими вариациями в г в диапазоне от типа клеток и соответствующие трудности точного прогнозирования его стоимости. Здесь, используя «истинного» клеток определенных кривой Z Moxi установки в сочетании с алгоритмом коррекции совпадение, Moxi Z динамически корректирует совпадение для достижения истинной концентрации. По сравнению с результатами, полученными с использованием высоких конец Coulter Z2, Moxi Z производится подсчет сопоставимых по концентрации диапазоне 0 - 500 000 клеток / мл (Type M кассеты) и 3000 - 2-2.5e ^{6 кл} / мл (кассета типа S) . Кроме того, Moxi Z достигает этот счет точности с аналогичным низким коэффициентом вариации графов и точность размеров частиц, что характерно для золотого стандарта, Coulter-техника подсчета клеток.

Кроме того, данные, представленные здесь, показывают, что Moxi Z может дать ценную информациюотносительно общего состояния клеточных культурах. Moxi Z использует кривой подход, собственный алгоритм программного обеспечения для определения этой оценки культуры здоровья. Морфологические изменения, связанные с гибелью клеток, таких как blebbing, разваливается, и объемные искажения (Катаока и Tsuruo 1996 Liegler и др., 1995, Шеридан и др. 1981), ^12-14, позволяют Moxi-Z отличить impedimetric различия между жить населению и мертвых клеток / мусора населением. MVI формируется на основе анализа культуры / распределения частиц по размерам для определения относительного вклада частицы мусора, усохшие отмершие клетки, а кривая оборудованные клеточной популяции интерес. Значение MVI что отражает индекс населения или радиометрический мера монодисперсных рассчитывает населения по отношению к общим профилем населения частиц. Это значение затем алгоритмически с поправкой на основе демографической статистики и эмпирических наблюдений. Becausе MVI смотрит на параметры, кроме традиционных подходов окрашивания, не ожидается, чтобы отразить эти методы, но вместо этого предоставляет ценную зрения альтернативной в здоровье клеточных культурах, особенно в связи с мусором и микробного загрязнения.

Таким образом, Moxi-Z ячейки счетчика сверхкомпактных настольных инструментов, что обеспечивает точное, воспроизводимое анализов клеток, размер ячейки, а ячейки здоровья, используя принцип Coulter и построения кривой алгоритмов программного обеспечения в сочетании с запатентованной тонкопленочных сенсорных технологий . С кассетой M Тип способен подсчета частиц от 4 - 25 мкм в диаметре (динамический диапазон 2 - 34 мкм), в 8 секунд. С кассетой типа S способен подсчета частиц в диапазоне от 3 - 20 мкм в диаметре (динамический диапазон 2 - 26 мкм), в 15 секунд. Кроме того, Moxi-Z выполняется оценка состояния здоровья без использования реагентов. Это гораздо меньше труда, инnsive и субъективным, чем ручной подсчет. По сравнению с подсчетом стандартных Coulter, Moxi быстрее, значительно меньше, предоставляет больше информации, требует значительно меньшего ухода, проще в использовании, и часть стоимости.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
ORFLO Разбавитель	ORFLO	MXA006
Кассета диспенсер	ORFLO		Магазины до 25 кассет для удобного розлива
USB-кабель	ORFLO		Подключение прибора к ПК / Mac или адаптера питания
Адаптер питания (США и ЕС моделей)	ORFLO		Подключение USB-кабеля к розетке переменного тока
USB Flash Drive	ORFLO		Магазины МОКСя Z программное обеспечение и руководство пользователя
Бисер проверки калибровки	ORFLO
Электронная кассета калибровки	ORFLO		Электронная кассета для проверки правильной работы системы и калибровки