Крысы Брыжейка экстериоризации: модель для исследования Клеточная динамика, вовлеченных в ангиогенез

Резюме

В этой статье описывается простой моделью для стимуляции ангиогенеза у крыс брыжейки. Модель дает резкое увеличение капиллярной прорастания, сосудистые области и сосудистой плотности в течение относительно короткого времени курс в ткани, что позволяет в фас визуализацию всей микрососудистых сетей до одного уровня ячейки.

Аннотация

Microvacular роста сети и реконструкция представляют собой критические аспекты заживления ран, воспалений, диабетическая ретинопатия, рост опухолей и других патологических состояний ^{1, 2.} Сеть роста обычно связывают с ангиогенез, определяется как рост новых сосудов из уже существующих судов. Ангиогенных процесс также напрямую связаны с arteriogenesis, определяемый как капиллярная приобретение периваскулярных покрытие клеток и сосудов расширения. Излишне говорить, ангиогенез является комплексным и включает в себя несколько игроков на клеточном и молекулярном уровне ^3. Понимание того, как капиллярная сеть растет требует определения пространственной и временной динамике по иерархии сети за время хода ангиогенеза. Эта информация имеет решающее значение для развития методов лечения, направленных на манипулирование судно роста.

Экстериоризации модели, описанной в этой статье, представляет собой простой, воспроизводимой моделью стимулируетlating ангиогенеза у крыс брыжейки. Она была заимствована из ранозаживляющим модели у крыс брыжейки ^4-7, и является альтернативой для стимуляции ангиогенеза в брыжейке с помощью IP-инъекции проангиогенных агентов ^{8, 9.} Экстериоризации модель привлекательна тем, что требует минимального хирургического вмешательства и производит драматические, воспроизводимые увеличения капиллярного капуста, сосудистые области и сосудистой плотности в течение относительно короткого времени курс в ткани, что позволяет двумерной визуализации всей сети микрососудов до одного клеточном уровне. Стимулировал рост отражает естественный ангиогенных ответы в физиологическом среде без вмешательства иностранных ангиогенных молекул. Использование иммуногистохимических методов маркировки, эта модель была оказались чрезвычайно полезными для выявления новых клеточных событий, участвующих в ангиогенеза. Следователи легко соотнести ангиогенных метрики во время хода реконструкции со временем зрecific динамики, таких как сотовые фенотипические изменения или межклеточных взаимодействий ^{4, 5, 7, 10, 11.}

протокол

1. Хирургическая процедура установки Notes

1. До операции стерилизации хирургических материалов и инструментов. Поставки для стерильные хирургические процедуры для каждой крысы включают 1 драпировка быть уложены так, как стерильную поверхность для размещения инструментов, один с драпировкой нарезанные отверстия около 0,5 х 1,5 в в центре будет находиться над крысой , а также марлей. Нарезанные отверстия на драпировка будет строиться с учетом разрез, сделанный на крысу. Инструменты, необходимые для операции включают в себя 1 стандартный ножницами, которые будут использоваться, чтобы сократить шовного материала, два пинцета и тонких иглодержатель для обработки и захвата в шов, а скальпель с лезвием. Мы перечислили общие инструменты, используемые в нашей лаборатории в таблице конкретных хирургических материалов и инструментов. Тем не менее, окончательный выбор инструмента зависит от экспериментатора предпочтений.
2. Подготовка операции пространства. Положите 100 мл 0,9% стерильного физиологического раствора сумку под грелку для того, чтобы соленый, что вступает в контакт сого брыжейки ткани предварительно нагревают до приблизительно 37 ° C. В качестве альтернативы солевого раствора, можно использовать раствор Рингера или иным физиологическим буфером. Выложить стерилизовать хирургические инструменты и материалы на стерильной драпировки для быстрого доступа во время экстериоризации процедуры. Кроме того, вам нужно стерильной ватой кончик аппликатора и соответствующая 3-х видов швов (4-0, 5-0, и 7-0). Делает, что пакеты предварительно открыт, так что материалы могут быть доступны стерильной обработки. Наконец, дезинфекции предварительно модифицированный пластиковый этапе путем погружения его в 100% этанола, по крайней мере 5 минут. Сцена 100 мм чашки Петри с эллиптической отверстие в центре (рис. 1). Инструмент Dremel может быть использована на начальном этапе сделать и, при необходимости, расширить отверстие. После того, как отверстие сделано, по краям разреза пластика сделаны гладкими наждачной бумагой различного зерна. Этап затем промывают и, наконец, как инертный лепка из глины (купить в местном магазине ремесла) или силикономна клей добавляют края дыры, чтобы обеспечить подняли, гладкую поверхность. До контакта с тканью, на сцене должны быть адекватно промыть стерильным физиологическим раствором.
3. Для этой модели ангиогенеза, мы обычно используем взрослый мужчина крыс Вистар (350 ± 25 г). Другие штаммы крыс и возраста могут быть использованы. В нашей лаборатории, крысы под наркозом с помощью внутримышечной инъекции кетамина (80 мг / кг массы тела), ксилазина (8 мг / кг массы тела) и атропин (0,08 мг / кг массы тела). Примерно через 5 минут, эффект обезболивания подтверждается и кожа живота крыс бреется.

2. Крысы Брыжейка экстериоризации модели

1. Установите под наркозом крыса на спине на грелку для поддержания температуры тела. Асептические методы используются во время хирургического вмешательства. Носите стерильные перчатки и не позволяйте инструментов и принадлежностей, чтобы связаться нестерильных поверхностей, кроме тканях крыс.
2. Очистите брюшной области с чередующимися салфетки УЗИнг стерильной марлей, смоченной в 70% изопропиловый и йод.
3. Используя лезвие скальпеля, сделать небольшой (примерно 0,75 дюйма) продольный разрез по коже, а затем белой линии приблизительно на 1 дюйм ниже грудины.
4. Положите нарезанные драпировка на брюшную часть так, что открытие совпадет с разрезом.
5. Аккуратно надавите вокруг разреза. Как правило, это приведет к воздействию тонкой кишки достаточно для того, чтобы быть легко идентифицирован.
6. С помощью аппликатора хлопок наконечником, осторожно извлеките часть тонкой кишки и подвздошной кишки найти. Как брыжейки вырывается, она должна быть аккуратно уложены в пластиковую этапа (рис. 2).
7. Определите 6-8 окон васкуляризированной брыжеечной. Брыжеечной окна определяется как тонкая полупрозрачная мембрана между артерии / вены пары кормления тонкой кишки (рис. 2).
8. Запишите время начала экстериоризации. Оставьте mesenteры разделе экстериоризируется в течение 20 минут. Во время экстериоризации период, использовать стерильный шприц (5 мл), чтобы периодически пополнять физиологический раствор в чашке Петри, чтобы убедиться, что ткань остается погруженным и не высыхает.
9. Во время 20-минутной экспозиции, отметить 2-центре брыжеечной окна стерильным 7-0 шва. Знаки должны быть сделаны в жировых районе рядом с кишечником.
10. Вернуться экстериоризируется области брыжейки на брюшной полости.
11. Закройте брюшной мышцы с 5-0 мононити шов в прервал картины.
12. Закройте кожу 4-0 шовные мононити в прервал картины.
13. Протрите зашивается области с чередующимися салфетки помощью стерильной марлей, смоченной в 70% isopropoyl и йод.
14. Распространение гель глаз смазки на оба глаза крысы. Цель смазки глаз, чтобы предотвратить высыхание роговицы во время хирургической процедуры и восстановление. Применение смазки глаз следует применятьдо начала хирургического вмешательства. В случае необходимости, повторно применять смазку глаз до возвращения крыс в клетку для восстановления.

3. Сбор ткани и фиксации

1. В день стимуляции интереса пост, анестезию и усыпить крысу. В нашей лаборатории, крысы под наркозом с помощью внутримышечной инъекции кетамина (80 мг / кг массы тела), ксилазина (8 мг / кг массы тела) и атропин (0,8 мг / кг массы тела), а затем с помощью эвтаназии внутрисердечной инъекции beuthanasia. Beuthanasia является фенобарбиталом натрия / фенитоин решение, которое может использоваться для быстрой и безболезненной эвтаназии. На крыса нашей лаборатории обычно вводится 0,1 - 0,2 мл.
2. Снова откройте брюшной полости и осторожно удалить тонкую кишку и найдите два выраженных окон.
3. Вырежьте каждый из окна экстериоризируется брыжеечной с помощью щипцов и микро-ножниц. В том числе границы жира в окно выгодно для последующего распространения на ткани микроскопом. Немедленно, Погрузить каждого окна в PBS. При резке, старайтесь избегать, проходящем через артерии / вены пар в жир границе окна, чтобы минимизировать потенциальные кровенаполнения окна. Кроме того, свести к минимуму, проходящем через кишечник, что приводит к кишечным содержание связаться окна.
4. Используйте пинцет, чтобы распространяться на ткани положительно заряженных слайды микроскопом. Два тканей может быть установлена ​​на слайд.
5. Дайте ткани частично высушить и использовать лезвие скальпеля удалить лишний жир.
6. Ткани теперь готовы быть исправлены. Типичные методы фиксации могут быть использованы. В нашей лаборатории мы обычно фиксируем слайды в метаноле (-20 ° C) в течение 30 мин. Успешное маркировки также была выполнена с нефиксированной ткани. Фиксация методов может зависеть от ваших предпочтительных антител.

4. Ткань Immunolabeling

1. Ткани могут вообще теперь быть маркированы в соответствии с инструкциями на антитела для иммуногистохимии. Учитывая нашу заинтересованность в выявлении ролисосудистых перицитов в ангиогенез, наша лаборатория обычно помечает для эндотелиальных клеток и периваскулярных ^{10, 12, 13.} Полезные метки для идентификации эндотелиальных клеток по иерархии микрососудистых сетей анти-PECAM антител или BSI-лектинов. Периваскулярная маркеры ячейки, используемые в этой ткани включают NG2, десмин, SM-α актина, PDFGRβ и III класса β-тубулина. Ниже, в разделе 3.3, мы перечислили протоколов колориметрический и флуоресцентные протоколов PECAM immunolabeling.
2. До начальной основной инкубации антитела, слайды сушат в вакууме, чтобы удалить избыток буферного раствора. Кроме того, ткани, первоначально изложенные с воском перо, чтобы предотвратить неконтролируемый поток антител решения от ткани. Наконец, все маркировки шаги будут промывки. Для промывки, слайды должны быть размещены внутри окрашивания банки. Буферный раствор обмениваются 3 раза во время стирки срок.
3. Эндотелиальных клеток антителами маркировки процедуры: <с классом = "jove_step"> PECAM колориметрический Lableing
   1. Первичная инкубации антитела: Капельное примерно 100-200 мл первичной решение антител (1:200 мышь моноклонального антитела CD31 антитела разбавляют в буфере (0,1% сапонин в PBS + 2% BSA)) на вершине каждой ткани, убедитесь, что все ткани покрытых антителами решение. Инкубация в течение 1 часа при комнатной температуре.
   2. Вымойте тканей PBS +0.1% сапонина в течение 30 минут.
   3. Вторичный инкубации антитела: Капельное вторичном решение антител (Vectastain Elite ABC решение от Vector Laboratories, пероксидазы стрептавидина вторичном решение антител) в верхней части тканей. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 часа.
   4. Вымойте тканей PBS +0.1% сапонина в течение 30 минут.
   5. Инкубируйте тканей с векторным Новая Красная течение 15 минут. Затем поднимитесь тканей с водой.
   6. Горе слайдов: Dip слайдов в 95% этанола в 10 раз. Погрузитесь скользит в 100% этилового спирта в течение 2 мин. Погрузитесь слайдов в другой 100% этанола такрешением для 2 мин. Затем погрузите слайдов последовательное 100% ксилола решения в течение 2 минут. Дайте высохнуть и покрывают ткани тонким слоем VectaMount и покровное.

   PECAM флуоресцентная маркировка

   1. Первичная инкубации антитела: Капельное примерно 100-200 мл первичной решение антител (1:200 мышь моноклонального антитела CD31 антитела разбавляют в буфере (0,1% сапонин в PBS + 2% BSA)) на вершине каждой ткани, убедитесь, что все ткани покрытых антителами решение. Инкубация в течение 1 часа при комнатной температуре.
   2. Вымойте тканей PBS +0.1% сапонина в течение 30 минут.
   3. Вторичный инкубации антитела. Капельного вторичном решение антител ((1:100 стрептавидином Cy3 разводят в буфер антител (0,1% сапонин в PBS + 2% BSA)) в верхней части тканей Инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 часа.
   4. Вымойте тканей PBS +0.1% сапонина в течение 30 минут.
   5. Горе слайдов: Капельное 50:50 PBS с глицерином в верхней части тканей. Покрытиес покровным стеклом. Затем с помощью лака для ногтей для герметизации зазора между крышкой и скольжения слайдов.

5. Представитель Результаты

Представитель изображение крысы брыжейки тканей иммуногистохимическое предназначенного для PECAM показаны на рисунке 3. PECAM маркировки определяет все типы судов по иерархии реконструкции микрососудистой сети и может быть использована для количественного ангиогенных метрики в специфической стимуляции время после точки. PECAM маркировки позволяет для определения артериол против венул. Кормление артериол обычно имеют меньший диаметр и удлиненные эндотелия морфологию клеток по сравнению с парными венул (рис. 4). Капилляры и капиллярное ростки могут быть определены в зависимости от их диаметра сосуда и относительное положение в сети. Типичные характеристики реконструкции сетей включают увеличение капиллярной всходов, судно плотность сосудистой области и венул tortuosность. Количественная оценка различных ангиогенных метрики определяет время хода роста сети (рис. 5). Капиллярная прорастания из уже существующих судов, в пределах от 3-й день и 5-й день и возвращается к нестимулированных уровне 10 день. Это преходящее повышение прорастания сопровождается увеличением плотности сосудистой и сосудистой области. В качестве доказательства для реконструкции более крупных судов в этой модели, количество артериол и венул сегментов увеличивается с течением времени курс.

В нашей лаборатории, эта модель была использована для определения сотовой фенотипические изменения в определенный момент времени, в течение этого процесса ремоделирования ^{10, 11.} Например, класс III β-тубулина определяет перицитов по ангиогенных сосудов (рис. 6). В нестимулированных ткани, класс III β-тубулина выражение конкретного нерва. В противоположность этому, во время пика капиллярной прорастания, класс III β-тубулина выражается периваскулярных клеток. Этот типрезультата подчеркивает использование этой простой и надежной ангиогенных модель для определения новых типов клеток, участвующих в процессе ангиогенеза.

Рисунок 1. Изображения пластиковых стадии пре-и пост-модификации. Предварительно изменения этапе 100 мм чашки Петри. Изменения включают эллиптический разрез отверстием в центре и последующее добавление лепка из глины или кремния клеем края отверстия для создания подняли, гладкую поверхность. Эта поверхность представляет собой внутреннюю границу, которая облегчает superfusion из окна экстериоризируется брыжеечной. Шкала бар 1 см.

Рисунок 2. Образ экстериоризируется области мезентериальных. Брыжеечной окна определяется как тонкая полупрозрачная мембрана между артерии / вены пары кормления в тонком кишечнике. Во время экстериоризациипродолжительность, брыжеечных региона изложены и погруженный в солевом растворе в блюдо изменения Петри. Инертные желтой глины моделирования обеспечивает гладкую поверхность для брыжейки вырваться через нарезанные отверстия. Шкала бар 1 см.

Рисунок 3. Представитель изображения брыжеечной микрососудистых сетей от нестимулированных тканей и тканей на 3 и 10 дней после экстериоризации брыжейки. PECAM маркировке определить иерархию микрососудистых сетей в том числе, артериол (А), венул (V) и капилляры (C). Сообщение стимуляции, микрососудистой сети отображается увеличение капиллярной прорастания (наконечники стрел), и судно плотности. Шкала бар составляет 100 мкм.

Рисунок 4. Представитель изображения артериол / венулы пар в течение взрослой сети брыжеечной микрососудистых крысыс. В обоих изображений, артериол (А) может быть дифференцирована от венул (V), основанный на меньший диаметр и относительная удлиненные эндотелия морфологии клетки. Масштаб баров 20 мкм.

Рисунок 5. Представитель количественного ангиогенных метрики с течением времени курс микрососудистых экстериоризации сообщение брыжейки роста. А) в области сосудистой ткани области. Б) число побегов в капиллярной сосудистой области. C) Всего сосудистой длиной в сосудистой области. * Представляет существенной разницы по сравнению с нестимулированных группы. Статистические сравнения были сделаны с помощью однофакторного дисперсионного анализа следует теста Данна. (Р <0,05). ООН представляет нестимулированных.

Рисунок 6. Представитель флуоресцентных изображений мезентериальных микрососудистых сетей от нестимулированных тканей и тканей на 3 и 10дней после экстериоризации брыжейки. Иммунофлуоресцентного PECAM маркировку (красный) определяет эндотелиальных клеток и класса III β-тубулина маркировку (зеленый) определяет нервов (наконечники стрел) и периваскулярных клеток (стрелки). Периваскулярная клетки временно upregulate класса III β-тубулина в капиллярной прорастания. В нестимулированных микрососудистых сетей, класс III β-тубулина является нерва конкретным и не идентифицирует периваскулярных клеток. Через 3 дня после стимуляции, класс III β-тубулина положительно называет периваскулярных клеток по микрососудов. К 10-й день, класс III β-тубулина экспрессии начинает возвращаться к нестимулированных сценарию. Шкала бар составляет 50 мкм.

Рисунок 7. Изображения поддержки возможности отслеживания предварительно помечены локально применять клеток в процессе роста микрососудистой сети стимулируется брыжейки экстериоризации. Клетки superfused за mesenterIC окна в течение 20-минутного периода экстериоризации. 1 день после операции, DiI меченых клеток (красный) наблюдаются в фокальной плоскости дама с положительным PECAM микрососудов (зеленый). A, B) Примеры DiI меченых клеток костного мозга выставке округлены и вытянуты морфологии. В некоторых случаях (стрелки) клетки вытянуты вдоль микрососудов. C) Пример кластера DiI помечены мезенхимальных стволовых клеток вблизи вершины капиллярной росток (стрелка). Масштаб баров 50 мкм (А) и 20 мкм (B, C).

Обсуждение

Экстериоризации модели было сообщено в 2006 году и взят из предыдущей механических повреждений брыжейки крысы моделей ангиогенеза ^4-7 и производит аналогичные результаты хорошо установленных IP-моделей инъекции, которые используют крыс брыжейки ^9. 20 минут экстериоризации время экспериментально установлено, производить надежные ангиогенного ответа. Хотя этот период времени может быть изменена, она позволяет местным применением ингибиторов ангиогенеза ⁴ механистического исследования и непосредственное применение экзогенных клеток для исследования клеточной линии. Возможность включения в клетке реконструкции брыжеечной ткани поддерживается предварительные исследования в нашей лаборатории с использованием предварительно помечены клетки костного мозга и мезенхимальные стволовые клетки (рис. 7), и успех расследования судьбы человеческой жировой ткани, производных стромальных клеток инъекции IP ¹⁴ . В нашей лаборатории, мы использовали эту модель для определения перицитов фенotypic изменения с течением времени ход кровеносных сосудов ответ ¹⁰ и оценить потенциал ангиогенеза при патологических состояниях, таких как гипертония ^12. Ангиогенных ответ и клеточный фенотип изменения, связанные с этой моделью можно наблюдать и в других крыс брыжеечной ангиогенных моделей, включая хронической гипоксии экспозиции ^{10, 11.}

Ограничение экстериоризации модели является то, что точный запуск механизмов ангиогенеза неизвестно. Экстериоризации брыжейки была связана с дегрануляцию тучных клеток и увеличение уровня гистамина ^6, но необходимы дальнейшие исследования, чтобы получить более глубокое. Ангиогенных стимул, несомненно, является многофакторным, создавая надежный ответ реконструкции всей иерархии микрососудистой сети. В то время как неизвестные механизмы остаются серьезной критики этой модели, ее воспроизводимость и простота делают его привлекательным для выявления клеточной динамики involВЭД в заведомо сложной капиллярной прорастания процесс. Воспроизводимость модели поддерживают сопоставимых ангиогенных метрики с течением времени курс микрососудистых роста сети на нескольких штаммов крыс (мужские и женские линии Вистар Sprague-Dawley) в ранее опубликованных исследований, проведенных в нашей лаборатории ^{10, 12.} Так, большинство из тканей взрослого брыжеечной крысы являются васкуляризированной, модель также позволяет нескольким ткани должны быть рассмотрены на животное. К сожалению, эта модель не является, очевидно, применимы к генетической модели мыши, окна мышью брыжеечной меньше родной васкуляризации и, по нашему опыту, обычно не хватает наблюдается разветвление сети. Будущие приложения включают исследование судно функциональность при использовании ангиогенеза внутри жизненно микроскопии в определенные моменты времени и исследование связанных клеточной динамики, участвующих в лимфангиогенеза и нейрогенез. Хотя степень васкуляризации в родной брыжеечной окно, кажется, ROUghly пропорциональна возрасту, мы наблюдали ветвления микрососудистых сетей у самцов крыс Вистар в возрасте 4-5 недель. Эти наблюдения позволяют предположить, что экстериоризация модель также может быть применен для сравнения ангиогенных различия в возрасте.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Имя	Компания	Номер по каталогу	Дополнительные комментарии
Драпировать	Cardinal Health	4012	12 "x12" Bio-Shield Регулярные стерилизации Обертывания
Нойес Micro Scissor	Roboz хирургический инструмент	RS-5677	Нойес Micro Анатомический Весна ножницы; Прямо, Sharp-Blunt центров; режущей кромки 13 мм; 0,25 мм Ширина Совет, 4 1/2 "Общая длина
Грефе Forcep	Roboz хирургический инструмент	RS-5135	Micro диссекции, Зубчатые, небольшим изгибом; 0,8 Ширина Совет, 4 "Длина
Грефе Forcep	Roboz хирургический инструмент	RS-5130	Micro диссекции, зубчатые, прямые, 0,8 мм Ширина Совет, 4 "Длина
4-0 шва	Ethicon	699G	(1,5 метрической) ETHILON Нейлон черный мононить Шовный
5-0 шва	Ethicon	8556	(1,0 метрической) PROLENE Polyprolene Шовный Синий мононить
7-0 шва	Ethicon	1647G	(0,5 метрической) ETHILON Нейлон черный мононить Шовный
Кастровьехо Micro Иглодержатель	Изобразительных средств наук	12060-02	Совет Ширина: 0,6 мм Зажимные Длительность: 5 мм Длина: 9 см Св `едения из достоверных источников
Кастровьехо Иглодержатель	Изобразительных средств наук	12565-14	Tip Shape: Прямые Совет Ширина: 1,5 мм Зажимные Длина: 10 мм Ножницы: Нет Блокировка: Да Длина: 14 см Зубчатые: Да
Ручка скальпеля	Roboг хирургические инструменты	RS-9843	Скальпель ручки, # 3, твердые, 4 "Длина
Стерильные хирургические лезвия	Цинциннати хирургической	0110	Нержавеющая сталь, размер 10
Чашку Петри	Fisher Scientific	08-757-13	Скошенные Ридж, Slippable

Имя	Компания	Номер по каталогу	Дополнительные комментарии
Beuthanasia	Schering-Plough Animal Health корпорации союза (упорядоченные от MWI ветеринарной питания)	MWI #: 011168	Активный ингредиент: на 100 мл, 390 мг фенобарбитала натрия, 50 мг натрия фенитоином
Кетамин	Fort Dodge Animal Health (упорядоченные от MWI ветеринарной питания)	MWI #: 000680	Kateset 100 мг / мл
Ксилазин	LLOYD. Инк (Упорядоченные от MWI ветеринарной питания)	MWI #: 009307	Anased 100 мг / мл
Солевой	Hospira Инк	94-217-JT
PBS	SIGMA	011M8207
Saponin	Сигма	BCBB4080
PECAM (CD31)	BD Pharmingen	553371
Стрептавидин-Cy3	Джексон ImmunoResearch	016-160-084
BSA	Джексон ImmunoResearch	096555
Vectastain Elite ABC	Vector Laboratories	PK-6100
Векторные Нова Красный	Vector Laboratories	SK-4800
VectaMount	Vector Laboratories	H-500