Выделение и культуры крысы эмбриональных нервных клеток: Быстрый протокол

Резюме

Мы описываем методологию быстрой, чтобы изолировать и культуры гиппокампе и коре нейроны от грызунов эмбрионов. Этот протокол позволяет проводить эксперименты, в которых почти чистой культуры нейронов не требуется.

Аннотация

Мы описываем быстрый способ отделить и культуры гиппокампа и коры нейроны от E15-17 крысиных эмбрионов. Эта процедура может быть успешно применен для выделения мышиных и человеческих первичных нейронов и нейронных предшественников. Диссоциированных нейронов поддерживается в бессывороточной среде до нескольких недель. Эти культуры могут быть использованы для nucleofection, иммуноцитохимия, нуклеиновых кислот подготовки, а также электрофизиологии. Пожилые нейронов культуры можно трансфекции с хорошей скоростью эффективность лентивирусов трансдукции и менее эффективно, с фосфатом кальция или на основе липидов такие методы, как липофектамина.

протокол

1. Поли-D-лизин (PDL): Подготовка

1. Добавьте 5 мл стерильной DDH ₂ O 5 мг PDL для получения маточного раствора 1 мг / мл.
2. Смешайте маточного раствора с помощью пипетки несколько раз.
3. Используйте сразу или хранить поли-D-лизин решения при температуре 2-8 ° C.

2. Поли-D-лизин (PDL): Покрытие пластиковой посуды культуре клеток

1. Развести PDL маточного раствора стерильной DDH ₂ O в конечной концентрации 10 мкг / мл.
2. Внесите достаточно раствора в 60 мм блюдо для покрытия культуры поверхности (3 мл на 60 мм блюдо).
3. Рок осторожно, чтобы обеспечить ровное покрытие культуры поверхности.
4. Выдержите покрытие пластин при комнатной температуре (RT) в течение ночи.
5. На следующий день, как правило, в день вскрытия, удаления поли-D-лизин Решение стремление и промойте кратко с 3 мл стерильной DDH ₂ O. Повторите этот шаг. После второго мытья, удаления воды полностью аспирации.
6. Плиты можно хранить при температуре 4 ° С в течение трех недель.

3. Поли-D-лизин (PDL) и Ламинин: подготовка и покрытие стекла двухпалатный Слайды

1. Mix PDL (1 мг / мл) и ламинин (1 мг / мл) растворы в стерильных DDH ₂ O до конечной концентрации 10 и 5 мкг / мл, соответственно.
2. Внесите достаточно раствора в лунки стекло двухкамерного слайд, чтобы покрыть площадь поверхности культуры (1 мл на каждую лунку 2 и стекло двухкамерного слайд).
3. Рок осторожно, чтобы обеспечить ровное покрытие культуры поверхности.
4. Выдержите покрытие пластин при комнатной температуре на ночь.
5. На следующий день, удалить поли-D-лизин-Ламинин раствор для покрытия через стремление и промойте кратко в два раза с 1 мл стерильной DDH ₂ O. После второго мытья, удаления воды полностью аспирации.
6. Палата слайды могут храниться при температуре 4 ° С до трех недель.

Примечание: Любое предметное стекло камеры могут быть покрыты followinг этого протокола. Мы часто используем двухкамерный слайды, потому что каждый слайд обеспечивает контроль испытания экспериментальной установки (например, по сравнению с необработанной лечение, по сравнению с нетрансфицированных трансфекции).

4. Вскрытие нейронов и культуры

1. Теплый следующие реагенты при 37 ° С на водяной бане:
   • TrypLE Экспресс на первоначальных 100 мл флакон.
   • Neurobasal/B27 полной среде (см. таблицу I). Объем подогревается в зависимости от количества блюд, что покрытие (например, 30 мл в течение десяти 60 мм покрытие посуда).
2. Добавьте 3 мл холодной решение Hibernate E-четыре 60 мм культуры блюд и 13 мл до 15 мл BD Сокол высокой четкости полипропилена конической трубе.
3. Добавить 25-30 мл холодной среды вскрытия (см. таблицу II, д-р Олимпия Meucci, личное сообщение) в каждой из трех блюд 100 мм культуры. Эти пластины, содержащей большой объем среды, будут использованы для мытья эмбрионы сразу после ихУдаление из амниотической мешка (шаги 4.7 и 4.8).
4. Эвтаназии E17 своевременной беременных крыс по CO ₂ в соответствии с здравоохранении политики на гуманное лечение и использования лабораторных животных и в институциональном утвержденного ухода за животными и использовать протокол.
5. Спрей нижней части живота с 70% этанола и сократить медиально через кожу и мышцы с ножницами подвергая матки и эмбрионов.
6. Удалите все плоды и поместить их в стерильную 100-мм блюдо с более холодной среды рассечение (25-30 мл, см. п. 4.3).
7. Вырезать эмбрионов с помощью небольшого ножницы из амниотической полости и разместить их во второй 100-мм блюдо с холодной среды рассечение.
8. Промойте эмбрионы при комнатной температуре, слегка наклоняя 100-мм блюдо в течение 5-10 секунд. Затем перенесите промытый эмбрионов третий 100 мм блюдо с рассечения среды. Два моет более среднего, как правило, достаточно, чтобы удалить все следы крови. Однако, если NECessary, мыть одно время с помощью новой 100-мм блюдо с 25-30 мл холодной среды рассечение.
9. Использование стереомикроскоп и изогнутых щипцов, извлечение мозга каждой крысы эмбриона, потянув за кожей и черепом. Положите весь мозг в одном из 60-мм блюда (как правило, не более чем на 5 мозги на блюдо) с холодным Hibernate Е. Храните эти пластины на льду.
10. Возьмите одно блюдо в то время, и при вскрытии микроскоп, разделить и изолировать полушарий головного коры удаления мозга и мозговых оболочек.
11. Дополнительно: разрез по средней линии мозга, гиппокампе извлечь, и следуйте приведенным ниже инструкциям, чтобы изолировать нейронов гиппокампа.
12. Соберите все расчлененный коры в 15 мл коническую ясно пробирку, содержащую 13 мл холодной Hibernate Е. Оставьте кору головного мозга на льду, пока все вскрытия будут завершены. Из-за своих небольших размеров, расчлененный гиппокампе может быть собрана в 1,5 мл Eppendorf трубки вместо 15 мл трубку. При необходимости на этом этапе коры илигиппокампе может быть помещен в криоскопической пробирки флакон, содержащий 1 мл Hibernate E + 2% B27 + гентамицин (50 мкг / мл) + Fungizone (250 нг / мл) в соотношении 2-4 или 2-4 коре гиппокампа в одном флаконе. Мозговая ткань может храниться при температуре 4 ° С в темное время суток на срок до одной недели (более поздние времена не тестируется пока). При необходимости использовать тонкий пинцет для передачи ткани головного мозга в 15 мл пробирку с Hibernate E, а затем следовать протоколу ниже, чтобы изолировать нейронов.
13. Передайте трубку капот культуре ткани. Позвольте коры осели на дне пробирки, а затем осторожно удалить супернатант.
14. Добавить 13 мл свежего E Hibernate в 15 мл коническую трубку, позволяющие коры оседают на дне пробирки и тщательно удалите супернатант. Повторите этот шаг еще 2 раза, а после последнего мытья, аккуратно удалите все средства массовой информации.
15. Ферментативно переварить кору головного мозга, добавив 1-2 мл (в зависимости от количества коры, использовать меньше изоляции гиппокампе) теплой ТрypLE Express. Закройте крышку трубки с парафильмом и плавать трубки в 37 ° С на водяной бане 10 минут.
16. Спрей трубка с 70% этанола, прежде чем открывать крышку и добавить 10 мл Hibernate Е. Позвольте коры, чтобы поселиться в нижней части трубы и удалите супернатант. Повторите этот шаг в три раза промыть TrypLE Express. В последний шаг, тщательно удалить все средства массовой информации.
17. Осторожно растереть (4-5 раз) коры в 2 мл Neurobasal/B27 полной среде с использованием пожарной полированного стекла Пастера (примерно 1 мм в диаметре). Будьте осторожны, чтобы избежать пузырей.
18. Повторить 4-5 раз другой стерильной стеклянной пипетки Пастера меньше в диаметре (т.е. пипетка о 1/2-3/4 мм в диаметре). Не используйте пипетку Пастера меньше этого или он будет разрушать клетки.
19. Позвольте оставшихся кусочков ткани (как правило, очень немногие, если таковые имеются), чтобы обосноваться.
20. Передача верхней одной клеточной суспензии в новый 15-мл трубку, оставив поселились кусочки ткани. Мехше, разбавленные суспензии клеток до 10-12 мл Neurobasal/B27 полной среде.
21. Хорошо перемешайте и разбавьте для подсчета клеток путем добавления 10 мкл клеточной суспензии до 490 мкл 50x Решение подсчет (см. таблицу III) в 1,5 мл Eppendorf трубку.
22. Пластина клеток на PDL-покрытие пластин при плотности 5,0 х 10 ⁴ / см ^2. Если nucleofection должны быть выполнены, мы рекомендуем нанесение клеток при более высокой концентрации (8-10 х 10 ⁴ / см ^2).
23. Как правило, мы проанализируем 9-10 плодов в эксперименте, так как примерно 13 х 10 ⁶ нейронов, полученных от каждого E17 плода. Если больше эмбрионов необходимы, чтобы убедиться, что вся процедура длится не более двух часов.
24. При желании, через 24 часа после изоляции, 10 мкМ цитозин-β-D-арабинофуранозида (AraC) могут быть добавлены к каждому блюду, в целях предотвращения распространения глии. Тем не менее, этот шаг не требуется, поскольку Neurobasal/B27 среднего подавляет пролиферацию глиальных, В соответствии с рекомендациями производителя (Invitrogen / Gibco).
25. Нейроны могут быть использованы для экспериментов, через 4-5 дней в лабораторных условиях, хотя точное время зависит от желаемой стадии дифференцировки. У нас есть культивируемых нейронов на срок до 4 недель без существенного снижения выживаемости (рис. 1).
26. Для длительного культивирования, замене культивирования средних каждую неделю с свежеприготовленный Neurobasal/B27 полной среде.

5. Представитель Результаты

Нейроны культивировали на предметные стекла камеры могут быть подвергнуты иммуноцитохимия. На рисунке 1 показан типичный образ корковых нейронов установлен после пяти дней в культуре и immunolabeled с анти-MAP-2 антител, чтобы показать нейронных процессов.

На рисунке 2 показан представитель образ нейронов гиппокампа крыс через 3 недели в культуре. Морфологии нейронов полностью дифференцированных клеток выделяется МАП-2 яmmunolabeling (MAP-2 нейронов маркер мышиных моноклональных антител клона AP-20, Джин Tex, Irvine, CA), следуя стандартной процедуре, как описано выше ^1. Изображения были визуализированы с Nikon Eclipse E400 вертикально флуоресцентный микроскоп оснащен EXI аква камеры (Qimaging), моторизованный Z-оси, а SlideBook5 приобретение / деконволюции программного обеспечения (Intelligent изображений Innovations, Inc, Денвер, Колорадо). Серии трехмерных изображений каждого картины были deconvoluted одного двумерного изображения и решены путем изменения сигнала отключение почти до максимальной интенсивности увеличить разрешение.

На рисунке 3 показана чистота нейронных культур. Белки лизатов были получены из нейронов крысы DIV7 культур (CTX), а также случай человеческой глиобластомы (GBM). Как и ожидалось, нейронные лизат сильно положительным для нейронов белки MAP-2 и отрицательной астроцитов GFAP маркером, тогда как GBM лизат белков отрицательный еили MAP-2 и положительный для GFAP.

Хотя в нашей протокола мы используем Hibernate E в течение нескольких лет, рассечения и промывки среды, недавно мы рассмотрели дополнительные и очень практично использовать его для сохранения тканей мозга для дальнейшего использования. На рисунке 4 показана дней в пробирке 5 (DIV5) Культура крысы корковых нейронов изолированной от коры хранить при температуре 4 ° C в течение одной недели в Hibernate E + B27 после их первоначального вскрытия из эмбрионов. Нейроны высевали на стекло двухкамерного слайд покрыты PDL и ламинин, как описано выше. Полученные изображения были deconvoluted использованием SlideBook5 приобретение / деконволюции программное обеспечение, как описано выше (рис. 2).

Рисунок 1. Представитель образ корковых нейронов nucleofected с pmaxGFP (Amaxa, Lonza, Walkersville, MD) и immunolabeled с ПДЧ-2 Антител, в красный цвет. Оригинальный увеличение 100x.

Рисунок 2. Представителю изображение, показывающее MAP-2 immunolabeling, красный, нейронов гиппокампа через 3 недели в культуре. DAPI окрашивания, в синем, показывает, клеточных ядер. Оригинальный увеличение 40x.

Рисунок 3. Вестерн-блот показывает чистоту нейронов клеточных культурах. 30 мкг крыс и человеческих нейронов лизатов GBM белки были разделены с помощью электрофореза и подвергается Вестерн-блот анализе в соответствии со стандартными процедурами ^1. Anti-MAP-2 кролика поликлональных из клеточной сигнализации (Денвер, штат Массачусетс), анти-GFAP антителами было мышиных моноклональных от Chemicon (Millipore, Billerica, MA), и мышиных моноклональных анти-Grb2 антител был из лаборатории BD трансдукция ( Sparks, MD). Grb2 был использован в качестве управления загрузкой.

Рисунок 4. Представитель фотографии дней в пробирке 5 (DIV5) корковых нейронов крысы получена из коры остается в Hibernate E + B27 при 4 ° С в течение одной недели после их вскрытия. А) фазового контраста нейроны культивировали на стекло двухкамерного слайдов. Оригинальный увеличение 20X. B) иммунофлуоресценции показывает выражение MAP-2 в нейронных процессах, в зеленом, культура была отрицательной для астроцитов GFAP маркером. DAPI окрашивания, в синем, указывает клеточных ядер. Оригинальный увеличение 40x.

Обсуждение

Метод вскрытия и культуры гиппокампа крыс и корковых нейронов описаны здесь позволяет проводить эксперименты с использованием почти чистый нейронных культур, выращенных в химически определенной среде (рис. 3). Хотя протоколы для культивирования почти чистый нейронов в сывор?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Реагент	Концентрация
Neurobasal	98%
B27	2%
Glutamax	0,5 мМ

Реагент	Концентрация
Глюкоза	16 мм
Сахароза	22 мм
HEPES	10 мМ
NaCl	160 мМ
KCl	5 мМ
Na 2 HPO 4	1 мМ
KH 2 PO 2	0,22 мм
Гентамицин	50 мкг / мл
Fungizone	250 нг / мл
рН	7,4
Осмолярность	320-330 мОсм

Реагент	Объем (мкл)
Neurobasal/B27 полной среде	240
Трипановый синевы 0,4%	250
Общий	490

Реагент	Компания	Кат. номер
Hibernate E	Brainbits	767171
Neurobasal	Gibco, Invitrogen	21103-049
B27	Gibco, Invitrogen	17504-044
Fungizone	Gibco, Invitrogen	15290-018
Гентамицина сульфат	Sigma Aldrich	G1264
Glutamax 200 мМ	Gibco, Invitrogen	35050
TrypLE Экспресс без фенола красного	Gibco, Invitrogen	12604
Цитозин-β-D-арабинофуранозида гидрохлорид	Sigma Aldrich	C6645
Поли-D-лизин	Sigma Aldrich	P6407
Ламинин 1 мг / мл	Millipore	CC095
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Трипановый синевы 0,4%	Gibco, Invitrogen	15250

Оборудование	Компания	Кат. номер
Стерео микроскоп	Олимп	SZ61
Большие щипцы	FST	11022-14
С острым концом щипцов	Мория	MC40B
Micro острым концом щипцов	Мория	MC31
Razor-острыми ножницами	Roboz	RS-6820
Micro Анатомический ножницы	FST	91460-11
Micro Анатомический изогнутые ножницы	FST	14067-11
Стекло 2-камерные слайды	Лаборатория-Tek	154461
60 мм блюда	BD Сокол	353002
100 мм блюда	Гранулирование	430167
15 мл труб	BD Сокол	352099
1,5 мл крио-трубка флакон	Nunc	375353