Генерация увековечен мышиного мозга микрососудистой эндотелиальной клеточной линии, как<em&gt; In Vitro</em&gt; Гематоэнцефалический барьер модели

Резюме

Этот метод описывает, как изолировать и увековечить микрососудистых эндотелиальных клеток из мозга мыши. Мы опишем шаг за шагом, начиная с протоколом гомогенизации ткани головного мозга, пищеварение шаги, посева и увековечение клеток. Как правило, это занимает около пяти недель до получения однородной, увековеченный микрососудистой эндотелиальной клеточной линии.

Аннотация

Эпителиальных и эндотелиальных клеток (ЕК) строят парацеллюлярный барьеры, которые защищают ткани от внешней и внутренней среды. Гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), состоящий из ЕС, астроцитов конечных ноги, перицитов и базальная мембрана несет ответственность за защиту и гомеостаза паренхимы мозга. Экстракорпоральное модели BBB являются общими инструментами для изучения структуры и функции BBB при клеточном уровне. Значительное число различных моделей в пробирке BBB были созданы для проведения исследований в различных лабораториях на сегодняшний день. Как правило, клетки получают из крупного рогатого скота, свиней, крыс или мышей ткани головного мозга (подробно обсуждаются в обзоре Вильгельм и соавт. ^1). Образцов человеческой ткани доступны только в ограниченном числе лабораторий и компаний ^2,3. В то время как первичные клеточные препараты занимают много времени и EC культур может отличаться от партии к партии, создание увековечили ЕС линэс находится в центре научного интереса.

Здесь мы представляем метод для установления увековечили мозга микрососудистых ЕС линии от неонатального мозга мыши. Мы описываем процедуру шаг за шагом каталоге реагентов и растворов, используемых. Метод установленном нашей лаборатории позволяет изоляции однородной увековечили эндотелиальной клеточной линии в течение четырех-пяти недель. Мозг микрососудистых эндотелиальных клеточных линий называется cEND ⁴ (из коры головного мозга) и cerebEND ⁵ (из коры мозжечка), были выделены в соответствии с этой процедурой в Ферстер лаборатории и были эффективно использованы для объяснения различных физиологических и патологических процессов на BBB. Использование cEND и cerebEND мы показали, что эти клетки реагируют на глюкокортикоидами ^4,6-9 и эстрогена обращения ^10, а также в про-infammatory посредников, таких, как TNFalpha ^5,8. Кроме того, мы изучили патологии несколькими ПКlerosis ¹¹ и гипоксии ^12,13 на EC-уровня. CEND и cerebEND линии можно рассматривать как хороший инструмент для изучения структуры и функции BBB, клеточные ответы ЭК на различные раздражители или взаимодействия ЕС с лимфоцитами или раковых клеток.

протокол

1. Выделение микрососудов головного мозга

1. Для каждого препарата использовании 9:55 новорожденных мышей обоего пола (3-5 дней).
2. Усыпить мыши в соответствии с местными IACUC / ветеринара рекомендаций, удалить мозг сразу, и передача в чашку Петри, содержащую следующие решения: 15 мМ Hepes (рН 7,4), 153 мМ NaCl, 5,6 мМ KCl, 2,3 мМ CaCl ₂ х 2H ₂ O, 2,6 мМ MgCl _{2 ×} 6H ₂ O, 1% (вес / объем) BSA (далее в качестве буфера).
3. Если не указано иное, все процедуры изоляции, должны быть выполнены при комнатной температуре (RT) (22-24 ° C) под капотом ламинарного потока. Вырезать мозга (мозжечок головного мозга без и ствола мозга), после удаления оболочки и капиллярные фрагментов в буфер, используя стерильный скальпель. Внесите фрагментов ткани вверх и вниз с помощью 10 мл пипетки, пока не появляются сгустки. Передача суспензии в 50 мл Сокол трубки и центрифуги при 250 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.

Примечание: мозговых оболочек может быть идентифицирован как тонкой, прозрачной мембраны на поверхности ткани головного мозга. Они могут быть тщательно удалены с стерильного пинцета.

4. Удалите супернатант.
5. Растворить осадок в 4,5 мл буфера с 1,5 мл 0,75% (вес / объем) коллагеназы / диспазы (Roche) и инкубировать в течение 45 мин при 37 ° С на водяной бане (периодически встряхивая).
6. Между тем, подготовка 12-луночные планшеты на покрытие четырех скважин с коллагеном IV (0,1 мг / мл, растворяют в 50 мМ уксусной кислоты). Разрешить придерживаться в течение 1 часа.
7. Остановить пищеварения добавлением 15 мл ледяного буфера А. Ресуспендируют осадок тщательно.
8. Центрифуга подвески при 250 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре.
9. Удалите супернатант.
10. Чтобы удалить миелин, добавляют 10 мл 25% (вес / объем) BSA (Sigma, чистота> 98%) и центрифуге при 1000 мкг в течение 20 мин при 4 ° C. 25% BSA следует растворить в 1x PBS (РАА Laboratories) и фильтруют через 0,2 мкм FILTER).
11. Аккуратно отбросить супернатант, осадок растворяют в 10 мл буфера и перенести в новую пробирку Falcon.
12. Центрифуга подвески при 250 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Полученный осадок содержит эндотелиальные клетки.
13. Мыть два раза коллагена IV покрытые 12-луночный планшет с PBS.
14. Ресуспендируют окатышей в 4 мл питательной среды (DMEM, содержащей 10% FCS, 50U/ml пенициллина / стрептомицина, 1% L-глутамина) и пластины клеточной суспензии в двух скважинах, 2 мл в каждую лунку. Добавить пуромицин до конечной концентрации 4 мкг / мл и инкубируют в течение 45 мин при 37 ° С в культуре клеток инкубатора. Этот шаг позволяет удалять быстро придерживаясь клеток. Примечание: Пуромицин добавлен в течение 24 часов. Только мозг по этике может усвоить это, для других типов клеток пуромицин является токсичным ^14.
15. Передача 2 мл среды, содержащей не-придерживался клетки шаг 1,14 на два свежих скважин (эти скважины содержат долю ЕС). Пополнить скважин с наклеенными клетки от стер 1,14 с 2 мл свежей среды (эти скважины содержать другие типы клеток, например, фибробласты, астроциты и могут быть выращены в параллельном и используется для сравнения морфологии).
16. Изменение среды на следующий день.

2. Увековечении мозга микрососудистой эндотелиальных клеток

1. Развивайте GP + E-86 Neo (GPENeo) ¹⁵ фибробластов, секретирующих репликации с дефицитом вируса полиомы онкоген средний T в DMEM среде, содержащей 10% инактивированной нагреванием FCS, 50U/ml пенициллина / стрептомицина и 2 мг / мл G418 ( . PAA Laboratories) в желатин покрытием колбы Примечание: полиомы средний T онкоген трансфекции вызывает рост преимущество ЭК над не-ECS приводит к однородной монослоя клеток эндотелия морфологии 4 до 6 недель культуры. GPENeo не являются коммерчески доступными и могут быть получены как общие материалы для общественности (см. оригинальных публикаций ^4,16).
2. Чтобы использовать вирус-содержащих среду для увековечение, развивать GPENeo клеток в G418 без среде в течение 24 часов.
3. Удалить 10 мл GPEneo супернатант и добавить полибрен (hexadimethrine бромид) (Sigma) до конечной концентрации 8 мкг / мл, стерилизуют через 0,45 мкм фильтр для удаления клеточных фрагментов.
4. Удалить рост средней из культур ЕС подготовлен в часть 1 и добавляют 2 мл супернатанта GPEneo / полибрен смесь в лунки. Повторите это на следующий день, используя свежие GPEneo супернатант / полибрен смеси. Примечание: полибрен используется, чтобы сделать поры в клеточной стенке для облегчения инфекции вирусные частицы).
5. Удалите супернатант GPEneo / полибрен смеси на следующий день, мыть клетки дважды с PBS и поддержания клеток в питательной среде изменяя его каждые 3 дня. После слияния, разделить клетки 1:2 по коллагена IV покрытием пластин.
6. Как правило, стабильные церебрального эндотелия (cEND) клеточных линий должно быть получено 4-5 недели позже.

е "> 3. Культивирование мозга микрососудистой эндотелиальных клеток

1. Оттепель клетки от cryoaliquot в ванну воды и передачи в 15 мл-Falcon 10 мл подогретого среды.
2. Центрифуга подвески при 250 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
3. Удалите среду, передает окатышей в коллагена IV покрытием T _{25 см} ² культуре клеток колбу с предварительно нагретой среде роста (плотность клеток для покрытия должна быть не менее 1x 10 ⁴ клеток / мл).
4. Изменение средней на следующий день и после того, как клетки достигали слияния (как правило, через 5 дней) разделить клетки.

4. Расщепление cEND-клеток (Примечание: Разделение должно быть сделано только раз в неделю, избежать раскола Выше, чем 1:4).

1. Удалить среды, мыть клетки с PBS.
2. Добавьте 3 мл теплой трипсин-ЭДТА (ПАК лаборатории) (T _{75 см} ² колбы), инкубировать при 37 ° C и подождите, пока слой клеток рассеивается (обычно от 5 до 15 мин).
3. Добавьте 5 мл осреднего роста F, пипетки вверх и вниз, и переход на новый коллаген IV покрытием колбы.

5. Замораживание cEND-клеток

1. Получение суспензии клеток, как описано в шаге 4
2. Центрифуга подвески при 250 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
3. Ресуспендируют осадок клеток (полученного из 1 т _{75 см} ² колбы) в 6 мл замораживания среднего (95% роста среднего, 5% DMSO).
4. Разделите клеточной суспензии на четыре 1,5 мл крио-аликвоты. Примечание: Один крио-аликвоты могут быть посеяны на T _{25 см} ² колбы.
5. Хранить крио-аликвоты при температуре жидкого азота паров.

cEND рост среднего: 450 мл DMEM, 10% FCS, 10 мл L-глутамина, 2% MEM-Kit, 2% NEAA, 10 мл натрия пируват, 50 ед / мл пенициллина / стрептомицина

6. Представитель Результаты

CEND и cerebEND клетки характеризуются immunostainings эндотелиальныхBBB-й маркеров, а также измерения трансэндотелиальной электрического сопротивления (TEER) и проницаемости. CEND и cerebEND был морфологии похожи на первичных культурах мозга ECS, с монослоев из плотно упакованных удлиненных клеток, которые выставлены торможение роста у слияния. Клетки выразил также определяемые уровни Claudin-5, occludin и VE-кадгерина белки, которые были локализованы в межклеточных контактов, как показано иммунофлюоресценции (рис. 3) ^4,5. Культивирование клеток cEND в сыворотке пониженной средней привело к увеличению TEER (от 150 Ωcm ² в присутствии 10% сыворотки до 500 Ωcm ² в присутствии 2% сыворотки), которое было усилено добавлением гидрокортизона (800 Ωcm ²⁾ или инсулин (1.000 Ωcm ^{2) 4.} Монослои cEND культивировали в сыворотке пониженной средней за 21 дней было TEER из 900 Ωcm ² (рис. 4). TEER измерялась с помощью сборкисодержащие тока и напряжения, проходящего-измерительные электроды (инструменты Всемирного Precision). Для сравнения, первичных микрососудов мозга этике, как сообщается, имеют TEER значений 200-600 Ωcm ² и коммерчески доступные линии клеток мыши bEnd.3 было TEER значений 100-140 Ωcm ² (для последнего обзора см. Abbot 2005 года и Тота и др. др.., 2011 ^17,18). Кроме того, прохождение макромолекул, таких как незаряженных FITC-декстрана молекулярной массой 4, 10, 70 и 500 кДа, или флуоресцеина (300 Da) через монослой cEND в 2% среднего дифференциации FCS в течение 4 часов был уменьшен по сравнению с контрольными клетками сохраняется в росте среде, содержащей 10% FCS: парацеллюлярный потока была снижена до 30% от контрольных клеток для флуоресцеина, до 26% для FITC-декстрана 10 и 70 кДа, и поток был снижен до 4,5% контрольных клеток для FITC -dextrtan 500 кДа. Как и в Тир значений, проницаемость была на самом низком уровне в клетки культивировали в присутствии Glucocorticoids (GC) ^4. В дальнейших исследованиях, мы определили глюкокортикоидных генов-мишеней, occludin, Claudin-5 и VE-кадгерина в мозг эндотелия сосудов ^4,7,9. GC лечение привело к увеличению экспрессии этих белков и к перестройке VE-кадгерина к цитоскелета. Прямые GC-опосредованной регуляции плотного контакта белков occludin и Claudin-5 появится через GC элементы ответа в своих регионах промоутер ^4,7,19. Кроме того, Claudin-5 была определена в качестве нового целевого эстрогена в эндотелий сосудов ^10.

Эндотелиальной дисфункции лежит в основе различных заболеваний. Мы культивировали cEND под кислород / глюкоза лишения (OGD) условиях. OGD привело к нарушению функции BBB, который может быть восстановлена ​​после комбинированного лечения с GC и ингибитора протеасом бортезомиб ^12. OGD условия привели к сильному увеличению усвоения глюкозы и в выражении глюкозы транспортировкаTERS в cerebEND, которые могли бы быть уменьшены путем добавления MK801, не-конкурентный ингибитор NMDA-рецепторов ^13.

Рисунок 1. Морфология мозга микрососудистых эндотелиальных клеток (cEND) через неделю после изоляции. Свет фотографий микроскопии были взяты под 6x (A) и 15x (B) увеличение. На острове сформированных колониями эндотелиальных клеток видны.

Рисунок 2. Морфология мозга микрососудистых эндотелиальных клеток (cEND) через один месяц после изоляции и увековечение. Свет фотографий микроскопии были взяты под 15-кратным увеличением. Сливающиеся, однородные эндотелиального монослоя клеток могут быть соблюдены.

Рисунок 3. Увековечен мозга microvasculар эндотелиальных клеток Claudin экспресс-5, occludin и VE-кадгерина. CEND клетки, выращенные на коллаген IV покрытием покровные и окрашивали антителами против Claudin-5 (A), occludin (B) и VE-кадгерина (C). Изображения, сделанные с помощью микроскопа Zeiss Axioscop2 под 40-кратном увеличении.

Рисунок 4. Измерение трансэндотелиальной электрического сопротивления (TEER) из cEND монослоя. CEND были выращены на коллаген IV покрытием Transwell фильтры (размер пор 0,4 мкм). После достижения слияния клетки поддерживается в среде, содержащей 2% FCS. TEER измеряли через 7, 14 и 21 дней, используя сборки, содержащей тока и напряжения, проходящего-измерительные электроды.

Обсуждение

Описанная процедура может быть использована для изоляции микрососудистых КЕ из разных линий мышей, а также из различных нокаут линий мышей для изучения конкретных изменений в сосудистой функции эндотелия. В качестве метода увековечение мы использовали преобразование с онкобелка мышиных полиомавирусов, полиомы средний Т-антиген. Он преобразует быстро незрелых клеток эндотелия в естественных условиях и в пробирке ^20,21,22. Другие способы увековечения этике описаны в литературе включают, например, увековечение с SV40 большого Т-антигена обезьяньего вируса вакуолизирующего 40 ^23, продукт гена аденовируса E1A ²⁴ или избыточная экспрессия каталитической субъединицы теломеразы человека ^3. Увековечение с PymT является специфичным для мышиного незрелых этике, которая позволяет получать однородные культуры EC от новорожденных мышей в течение короткого времени. Увековечению меняет свойства клетки и йэлектронной результаты, полученные с увековечили клеточных линиях должны быть сопоставлены ни с первичными клетками или с экспериментами в естественных условиях с мышами. PymT увековечили ЕС была описана, чтобы выразить высокие уровни фибринолитической активности в результате увеличения производства урокиназы типа активатора плазминогена и снижением производства ингибитора активатора плазминогена ^25. Прямое сравнение PymT увековечили bEND5 линии клеток с первичным КЕ показали, что как в пробирке BBB модели хорошо подходят для Т-клеточной адгезии исследования ^26.

Клеточных линий, установленных в соответствии с описанной процедурой может быть использован при малых числах проход для поддержания защитных свойств высокой выражении BBB и ЕС соединительных белков, а клетки теряют эти свойства в процессе старения. Таким образом, после потери защитных свойств, подготовка новой клеточной линии должны быть рассмотрены. Плотность сотового покрытия должна быть высокой для ЭК, так как это имеет решающее значение для пролиферации клеток. Это необходимо учитывать при выделении процедуры, а также поддержание увековечили ECS. Каждая новая линия клеток должны быть проверены на ее барьерных свойств и возможных загрязнений с другими типами клеток. ЕС монослоя могут быть окрашены с анти-galactocerebroside, анти-глиальных фибриллярный кислый белок и анти-гладких мышц антигена в качестве первичных антител, чтобы исключить загрязнение олигодендроциты, астроциты и перициты ^4,27. Для исключения загрязнения сосудистой meningal, выражение тромбомодулин могут быть проверены, которая выражается во всех сосудистых бассейнах, за исключением головного мозга ^28.

Интересно, что увековечили микрососудистых эндотелиальных клеточных линий, выделенных из различных областей мозга отличаются по своим барьерные свойства и чувствительность к провоспалительных стимулов. В качестве примера головного cEND и мозжечка линии cerebEND клетки можно отметить ^4,5. CerebEND показал, в сравнениив cEND, снижение уровня экспрессии основных компонентов плотный стык Claudin-1 и occludin. Тем не менее, уровни Claudin-3 и -12 были выше в cerebEND. Барьерную функцию клеток cerebEND пострадали гораздо больше в лечении воспалительных посредников, TNF, чем барьерные свойства cEND клетки сделал ^5. Высшее мозжечка уязвимости на воспалительные стимулы, можно наблюдать в естественных условиях у больных рассеянным склерозом и в его животной модели экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита ^29. Эти интересные результаты показывают необходимость создания и характеризующие человека в пробирке моделей для различных областей мозга, чтобы улучшить будущее лекарственных препаратов в мозг.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906	Чистота> 98%
коллагена IV	Sigma-Aldrich	C5533	50 мкг / мл в 50 мМ уксусной кислоты
Коллагеназы / диспазы	Roche	10269638001
Игла, модифицированной Орла среде (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796
Диметилсульфоксид (ДМСО)	Sigma-Aldrich	D2650
Эмбриональной телячьей сыворотки (FCS)	PAA лабораторий	A15110-1333	конечной концентрации 10%, инактивированной (30 мин при 56 ° C)
L-глютамин	Biochrom AG	K0282	Хранение: ≤ -15 ° C
MEM Витамины	Biochrom AG	K0373	Хранение: ≤ -15 ° C
Na-пируват	Biochrom AG	L0473
Неомицин (G418)	PAA лабораторий	P11-012
Номера для незаменимых аминокислот (NEA)	Biochrom AG	K0293	Хранения при 4 ° С
Penicilin / Стрептомицин	Biochrom AG	A2212	Хранение: ≤ -15 ° C
Фосфатным буферным раствором (PBS)	Biochrom AG	L1825
Полибрен (hexadimethrine бромид)	Sigma-Aldrich	107689	0,8 мг / мл в PBS, хранение при температуре -20 ° C
Пуромицин	Sigma-Aldrich	P8833
Трипсин / ЭДТА	Biochrom AG	L1825	0,05%, 0,02% ЭДТА в PBS