Оценка репликации и функции бета-клеток в Adenovirally-трансдуцированных изолированных островков грызунов

Резюме

Этот протокол позволяет выявить факторы, которые модулируют функциональную бета клеточной массы, чтобы найти потенциальных терапевтических мишеней для лечения сахарного диабета. Протокол состоит из обтекаемой метод оценки репликации островок и функции бета-клеток островков в изолированных крыс после манипуляций экспрессии генов с аденовирусов.

Аннотация

Гомеостаза глюкозы в первую очередь контролируется инсулином эндокринных гормонов и глюкагон, который вырабатывается в поджелудочной бета-и альфа-клетки, соответственно. Функциональные клеточной массы бета определяется анатомическими клеточной массы бета, а также способность бета-клеток в ответ на биогенной нагрузки. Потеря функциональной клеточной массы бета занимает центральное место как основные формы сахарного диабета ^1-3. В то время как снижение функциональной бета клеточной массы результате аутоиммунной атаки на сахарный диабет 1 типа, при диабете 2 типа, это уменьшение развивается как с неспособностью бета-клетки секретируют инсулин должным образом и разрушения бета-клеток из кадровых механизмов. Таким образом, усилия по восстановлению функциональной бета клеточной массы имеют огромное значение для лучшего лечения и потенциальных методов лечения диабета.

Ведется работа по выявлению молекулярных путей, которые могут быть использованы, чтобы стимулировать репликации и повышению функции бета-клеток.В идеале, терапевтических целей позволит улучшить как бета-клеточный рост и функцию. Возможно, более важно, хотя это определить, является ли стратегия, которая стимулирует рост клеток бета происходит за счет нарушая функцию бета-клетки (например, с некоторых онкогенов), и наоборот.

Путем систематического подавления или гиперэкспрессией выражение целевых генов в изолированных островков крысы, можно выявить потенциальных терапевтических мишеней для повышения функциональной клеточной массы бета ^4-6. Аденовирусных векторов могут быть использованы для эффективного гиперэкспрессией или нокдаун белка в изолированных островков крысы ^4,7-15. Здесь мы представляем способ манипулировать экспрессии генов использования аденовирусной трансдукции и оценить островок репликации и функции бета-клеток островков в изолированных крыс (рис. 1). Этот метод был использован ранее для определения новых целей, которые модулируют бета репликации клетки или функции ^{5,6,8,9,16,17.}

протокол

1. Аденовирусные трансдукция и культивирования Крысы островков

1. Подготовка 6-и не-культуры тканей покрытием пластины, добавив 2 мл среды (RPMI 1640 средах, содержащих 8 мМ глюкозы, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 50 ед / мл пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина) для необходимого количества скважин. Например, типичный эксперимент может потребовать трех скважин - по одной для не-Virus Control, вирус управления (например, GFP-экспрессирующих аденовирус), а в экспериментальной группе.
2. Теплые пластины до 37 ° C, поместив его в культуре ткани инкубатор, по крайней мере 30 мин.
3. Сразу же после крысы островок изоляции ^18,19, место 100-200 островков в отдельных скважинах 6-и не-культуры тканей покрытием пластины. Шестьдесят островки необходимы для секреции инсулина и анализы тимидина. Остальные островки могут быть использованы для изоляции РНК для исследования экспрессии генов или белков изоляции иммуноблоттинга.

[Примечание: Начиная с этого момента, пожалуйста, следуйте институциональных протоколов для обработки, использования и утилизации биологически опасных материалов.]

4. Осторожно вращать пластину довести островков в центре колодца.
5. Пипетировать аденовирус непосредственно на островки в центре блюда. Используйте 100-500 кратности инфекции (МВД, соотношение клеток-мишеней к вирусным бляшкообразующих единиц).
6. Пусть остальные островки в течение 5 мин.
7. Поместите пластину в культуре ткани инкубатор (37 ° C, 5% CO _2).
8. Через 24 часа, осторожно вращать пластину довести островков в центрах колодцы и передать островки помощью P200 микропипетки на новый и свежий содержащие средства массовой информации. Если островки привязываться к плите, они могут быть слегка выбили с кончика пипетки.

[Примечание: Чтобы убедиться в адекватной эффек трансдукциису, использование контроль вируса выражения GFP выгодно, так как островки могут быть отображены с помощью конфокальной микроскопии для проверки проникновения аденовирус в островок ядра.]

9. Культура островки для дополнительных 24-72 ч, в зависимости от желаемых сроков эксперимента в исследованиях оптимизации пилота. Например, индукция пролиферативной реакции могут потребовать раз от 24-72 ч или нокдаун гена может потребоваться 48 или 72 часов. Передача островков на свежий СМИ каждый день.
10. Для окончательного 24 часов эксперимента, культуры островков в среде, содержащей 1 мкКи ^{[метил-3} H] -thymidine/ml средства массовой информации (как правило, 1 мкл тимидина / мл среды).

[Примечание: Начиная с этого момента, пожалуйста, следуйте институциональных протоколов для обработки, использования и захоронения радиоактивных материалов.]

2. Анализ секреции инсулина

1. Подготовьтесекреции буфером (НКС) 10X маточного раствора (1,14 М NaCl, 47 мМ KCl, 12 мМ KH ₂ PO _4, 11,6 мМ MgSO ₄₎ и CaCl ₂ 100X маточного раствора (0,25 М CaCl _2). Эти растворы можно приготовить заранее и хранить при комнатной температуре.
2. Недавно подготовить 50 мл рабочего SAB (5 мл 10X SAB, 1 мл 1 HEPES М, 0,5 мл 100X CaCl _2, 0,28 мл 35% BSA, 0,11 г NaHCO _3, и стерильной водой до 50 мл) 50 мл коническую трубку и теплой до 37 ° С, поставив в 37 ° С водяной бане.
3. Внесите 10 мл рабочего SAB в 15 мл коническую трубку и добавьте 66,8 мкл 2,5 М D-глюкозы подготовить высокий уровень глюкозы (16,7 ммоль) SAB.
4. Добавить 44,8 мкл 2,5 М D-глюкозы в оставшиеся 40 мл рабочего SAB подготовить низкий уровень глюкозы (2,8 ммоль) SAB.
5. Обозначения трех 1,7 мл микроцентрифужных труб для каждой скважины 6-луночного планшета и добавить 1 мл фосфатно-солевом буфере (PBS).

[Примечание: Как островки являются радиоактивными, пожалуйста, следуйте институциональных протоколов для обработки, использования и захоронения радиоактивных материалов.]

6. Место 20 островков в каждом микроцентрифужных трубку. Сделайте все попытки добавить сравнительно размера островков каждого микроцентрифужных трубку. Например, каждая трубка может содержать 5 малых, 10 средних и 5 больших размеров островков (см. Рисунок 1).

[Примечание: Островки могут быть визуализированы с помощью либо рассечение стереоскоп или стандартного микроскопа.]

7. После того, как островки поселились в нижней части трубки под действием силы тяжести (~ 2 мин), аспирацию PBS с микропипетки и выбросить.

[Примечание: в качестве альтернативы решения под действием силы тяжести, трубы могут быть центрифугировали при 300 мкг в течение 1 мин.]

8. Для предварительной инкубации, добавить 400 мкл низкой Gluудобно расположиться SAB, поместите трубки (с крышками открытые) в культуре ткани инкубатор (37 ° C, 5% СО ₂₎ и предварительно инкубировать 60 мин. Аспирируйте предварительной инкубации низкий уровень глюкозы SAB и брака.
9. Для базальной секреции инсулина, добавьте 400 мкл низкий уровень глюкозы в SAB, поместите трубки (с крышками открытые) в культуре ткани инкубатор (37 ° C, 5% CO _2), и выдержать в течение 60 мин. Соберите низкий уровень глюкозы SAB и за исключением инсулина радиоиммунологического.
10. Для стимулировать секрецию инсулина, добавить 400 мкл высокий уровень глюкозы в SAB, поместите трубки (с крышками открытые) в культуре ткани инкубатор (37 ° C, 5% CO _2), и выдержать в течение 60 мин. Соберите высокий уровень глюкозы в SAB и за исключением инсулина радиоиммунологического.

3. Анализ тимидина

1. Добавить 1 мл PBS, после того, как островки поселились в нижней части трубки под действием силы тяжести, аспирации PBS с пипетки, отбросить, и повторить этоодин раз.
2. Добавить 500 мкл ледяной кислоты трихлоруксусной (ТСА, 10% вес / объем) и инкубировать на льду в течение 30 мин.
3. Центрифуга труб на 16 000 мкг в течение 3 мин при 4 ° C.
4. Аспирируйте ГТС, добавить 80 мкл 0,3 N NaOH, и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре. В течение этого времени энергично вихрь образцов в течение 5-10 с каждые 10 мин.
5. Добавить 4 мл Econo безопасного подсчета коктейль 7 мл жидкого сцинтилляционного счет трубы.
6. Добавить 50 мкл образца сцинтилляционного счет трубы, крышки трубки, встряхните кратко, и рассчитывать на сцинтилляционного счетчика.
7. Измерение концентрации белка использованием bicinchoninic кислоты (BCA) Анализ и 10 мкл образца в соответствии с протоколом производителя.

4. Анализ данных

1. Выполните следующие инсулина радиоиммунологического протокол производителя.
2. Нормализация секреции инсулина и данные тимидина с белком концentration.

5. Представитель Результаты

Пример эксперимента по оценке островок репликации и функции бета-клеток островков у крыс показано на рисунке 2. Этот пример показывает, что аденовирусная гиперэкспрессия гипотетический "ген № 6" надежно стимулирует островок репликации без изменения функцию бета-клеток. В верхней панели, результаты анализа включения тимидина показали, что увеличение выражения "Gene № 6" увеличивает синтез ДНК, если судить по включению тимидина. Потому что большинство клеток у крыс островок являются бета-клеток, вполне вероятно, что это увеличение тимидина указывает на увеличение бета репликацию клеток. Тем не менее, подтверждающих эксперименты должны быть выполнены, чтобы твердо установить это. В нижней части панели, результаты анализа секреции инсулина показали, что гиперэкспрессия "Gene № 6" не изменили одной из основных функций клетки бета, то есть яnsulin секрецию при низких и высоких глюкозы. Качество изоляции островок и здоровье островков после лечения аденовирусы указывается кратное увеличение секреции инсулина при низких и высоких концентраций глюкозы. Если увеличение выражение "Gene № 6" нарушением функции бета-клетки, это, скорее всего, отражается как уменьшение инсулин выделяется при высоких, стимулирующие концентрации глюкозы (16,7 мм). Кривой доза-реакция для различных концентраций глюкозы также может быть выполнена.


Рисунок 1. Обзор протокола оценки репликации островок и бета-функции клеток в изолированных островков крысы после аденовирусной опосредованных изменений в экспрессии генов. Свежевыделенных островков крысы подвергаются аденовирусов в течение 24 ч, а затем культивировали до 96 час. Тимидина оценивается в финале 24 ч, после чего измерения секреции инсулина внизким и высоким содержанием глюкозы.


Рисунок 2. Результаты эксперимента с использованием аденовируса контроля и аденовирус гиперэкспрессией гипотетический ген назвали «Гена № 6". На верхней панели отображается тимидина и нижней панели секреции инсулина.

Обсуждение

Создание путей, которые можно модулировать по стимулированию репликации и повышению функции бета-клеток имеют отношение к обоим основные формы сахарного диабета. Поскольку функциональные клеточной массы бета зависит от существования и функционирования инсулин клетки, оценки этих д?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
RPMI 1640 средств массовой информации	Гибко	11879
Пенициллина / стрептомицина	Гибко	15140
6-луночного планшета	BD-Сокол	35-1146	Non-TC лечение
[Метил-3 H]-тимидина	Перкин Элмер	NET027Z001MC	1 мКи / мл
Micro-пробирок	Denville	C2170	1,7 мл
NaCl	Сигма	59888
KCl	Acros	42409
KH 2 </ SUB> PO 4	Acros	20592
MgSO 4	Acros	41348
CaCl 2	Acros	34961
HEPES	Сигма	H0887	1 М раствора
35% BSA	Сигма	A7979
NaHCO 3	Acros	42427
D-глюкозы	Сигма	G8769
TCA	Fisher Scientific	SA9410-1	10% вес / объем
NaOH	Acros	12426
Сцинтилляционных счет трубы	Sarstedt	58,536	7 мл, ПП
Сцинтилляционных счет трубы колпачок	Sarstedt	65,816
Econo-Safe считая коктейль	RPI	111175
Инсулин РИА	Сименс	TKIN2
BCA Анализ Kit	Thermo Scientific	23250
			Оборудование
Центрифугировать	Эппендорф	5415R
Сцинтилляционных счет трубы стойки	Sarstedt	93.1431.001
Жидкий сцинтилляционный счетчик	Перкин Элмер	Tri-Carb 2910TR