Процедура изготовления нановолокон Биофункциональные

Резюме

Эффективный подход к подготовке нановолокон, украшенные функциональные группы, способные специфически взаимодействует с белками описано. Этот подход требует, прежде всего подготовка полимер, функционализированный с соответствующими функциональной группы. Функциональный полимер изготовлен в нановолокон по электропрядения. Эффективность связывания нановолокон с белком изучается с помощью конфокальной микроскопии.

Аннотация

Электропрядения является эффективным методом обработки для подготовки нановолокон украшены функциональных групп. Нановолокон оформлены с функциональными группами могут быть использованы для изучения материально-биомаркеров взаимодействия, т.е. выступать в качестве биосенсоров с потенциалом в виде отдельных детекторов молекул. Мы разработали эффективный подход к подготовке функциональных полимеров, где функции обладает способностью специфически связываться с моделью белка. В нашей модели системы, функциональная группа является 2,4-динитрофенил (DNP) и белок анти-ДНФ IgE (иммуноглобулин Е). Функциональным полимером, α, ω-би [2,4-динитрофенил капроновой] [поли (этилен оксида)-б-поли (2-метоксистирол)-б-поли (этилен оксида)] (CDNP-ПЭО-P2MS-ПЭО- CDNP), получают путем анионной полимеризации жизни. Бифункциональных инициаторов используются в полимеризации был подготовлен реакции переноса электрона из α-метилстирола и калия (зеркало) металла. 2-метоксистирол мономер был добавленпервым инициатором, с последующим добавлением второго мономера, окиси этилена, и, наконец, живой полимер был прекращен метанола. Α, ω-dihydroxyl полимера [HO-ПЭО-P2MS-ПЭО-OH] подвергают взаимодействию с N-2 ,4-DNP-∈-аминокапроновой кислоты, в связи DCC, в результате чего образуются из α, ω-би [ 2,4-dinitrophenylcaproic] [поли (этиленоксида)-б-поли (2-метоксистирол)-б-поли (этилен оксида)] (CDNP-ПЭО-P2MS-ПЭО-CDNP). Полимеры характеризуются FT-IR, ¹ H ЯМР и гель-проникающей хроматографии (GPC). Молекулярно-массового распределения полимеров были узкие (1.1-1.2) и полимеры с молекулярной массой более 50000 были использованы в данном исследовании. Полимеры были желтые порошки и растворимые в тетрагидрофуране. Растворимые в воде CDNP-ПЭО-P2MS-ПЭО-CDNP / DMEG (dimethoxyethylene гликоль) комплекс связывается и достигает устойчивое состояние с обязательным решением IgE в течение нескольких секунд. Более высокой молекулярной массой (нерастворимых в воде т.е. около 50.000) CDNP-ПЭО-P2MS-ПЭО-CDNP полимеры, содержащие 1% углеродных нанотрубок одной стены (ОУНТ) были обработаны в электроактивных нановолокон (100 нм до 500 нм в диаметре) на кремниевой подложке. Флуоресцентная спектроскопия показывает, что анти-ДНФ IgE взаимодействует с нановолокон, связываясь с DNP функциональных групп украшения волокон. Эти наблюдения позволяют предположить, что надлежащим функционализированных нановолокон перспективны для разработки устройств обнаружения биомаркеров.

протокол

1. Синтез α, ω-dihydroxyl полимера [HO-ПЭО-P2MS-ПЭО-OH]

1. Сборка реактора полимеризации, как показано на рисунке 1. Реактор для этого эксперимента состоит из 100 мл с круглым дном 2-колбу, имеющих стандартный конус внешний сустава (Chemglass), два управления потоком адаптеров с кранами (Chemglass), и один тефлоновой мешалкой. Адаптер (рис. 1) был использован для держать ультра высокой чистоты (UHP) азота, протекающий через систему в целях предотвращения попадания воздуха и влаги в инертной системе. Адаптер B (рис. 1) была использована для введения растворителя, мономера и инициатора в реакционную колбу.
2. Высушите 200 мл тетрагидрофурана (ТГФ) по металлическим Na, используя в качестве индикатора бензофенона, в течение как минимум 6 часов в сухой азот.
3. Высушите 10 мл 2-метоксистирол более гидрид кальция в течение 24 часов.
4. Подготовка холодной ванны температура поддерживается при температуре -78 ° С с использованием раствора изопропанолаго жидкого азота.
5. Добавить 25 мл ТГФ в колбе реакция полимеризации (см. Рисунок 1) в атмосфере азота газ и держать реактор под азотом в течение всего процесса полимеризации.
6. Место 100 мл круглодонную колбу, в суспензии.
7. Добавить 2 мл (0,27 ммоль / мл) раствора инициатора в реакционную колбу.
8. Inject первый мономер, 2-метоксистирол (4 мл) в реакционную колбу.
9. Разрешить протекания реакции в течение 40 мин.
10. Добавить 1 мл второго мономера, окиси этилена.
11. Разрешить полимеризации продолжать при комнатной температуре в течение двух дней.
12. Завершить полимера с HCl (6 м) / метанол (1/20, об / об).
13. Очищают полимера путем осаждения в гексане и сухого полимера в вакуумной печи.
14. Охарактеризовать полимеров с помощью ЯМР.

2. Функционализация α, ω-dihydroxyl Полимер с N-2 ,4-DNP-Ε-аминокапроновой кислоты для получения функциональных Polymэ-э, CDNP-ПЭО-P2MS-ПЭО-CDNP

1. В трех колбу, поместить α, ω-dihydroxyl полимера (0,05 ммоль), N-2 ,4-DNP-E-аминокапроновой кислоты (0,25 ммоль), DCC (0,15 ммоль) и DMAP (0,005 ммоль) и сушить на вакуумной линии в течение 4 часов.
2. Отфильтровываю сухом дихлорметане (10 мл) в колбе.
3. Отпустите вакууме под азотом и перемешать реакции в течение 12 часов при комнатной температуре.
4. Фильтр реакционной смеси и восстановить полимера путем осаждения в два раза гексаном и метанолом.
5. Сухой полимер осаждается в вакуумной печи при температуре 40 ° C.
6. Определить структуру полимера и функциональность ИК-и ¹ Н ЯМР.

3. Подготовка CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/SWCNT решение для электропрядения

1. Растворите 20 Вт% от CDNP-ПЭО-P2MS-ПЭО-CDNP в хлорбензол.
2. Растворите 20 Вт% и 40% со полистирола (MW 800000) в хлорбензоле подготовить два решения. Чем выше молекулярный полистирол используется для увеличенииэлектронной полимерной цепи-цепи запутанности и получения оптимальной вязкости, необходимой для электропрядения.
3. Смешайте растворы полимеров подготовлен в 3.1 и 3.2 вместе, чтобы сформировать 1:1 и 1:2 соотношение полимеров и добавить 1 Вт% однослойных углеродных нанотрубок (ОУНТ) к смеси и перемешивают в течение ночи для равномерного распределения УНТ.

4. Электропрядения Полимер-CNT композитных

1. Соберите электропрядения установить, как показано на рисунке 2. На правой стороне рисунка является Глассман источника высокого напряжения. Рядом с ним находится реторты стенд, на котором кремниевой пластине прилагается. Слева находится еще один реторты стенд, на котором установлен шприц и за это лампа для визуализации процедура, как она прогрессирует.
2. С помощью шприца для подкожных инъекций, снять небольшое количество CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/polystyrene/SWCNT смеси (около 1 мл) и установите шприц на подставке штатива.
3. Кремниевой пластины гораред через дорогу от шприца надежно на расстоянии 10 см, а земля клип на источник высокого напряжения прилагается к нему.
4. Прикрепите хомут подшипников высокого напряжения, подаваемого на иглу на шприц, нажмите на поршень немного (чтобы приостановить падение на кончике иглы), и в этот момент, электропрядения готов.
5. Включите источник высокого напряжения и регулировать напряжение метр до 10 кВ. В зависимости от природы полимера в композите, более высокого напряжения может потребоваться, особенно если нановолокон под сотен нанометров в диаметре лучшего.
6. Отключить кремниевой пластине и место в эксикаторе в течение ночи до полного высыхания.

5. Характеристика нановолокон

1. Начальная изображения нановолокон делается с оптическим микроскопом наблюдать за общей точки зрения волокон.
2. Использование сканирующего электронного микроскопа наблюдать тонкие детали, как морфология, диаметр, средний размер пор и т.д.
3. Проводитьдальнейшие изображений с атомно-силового микроскопа наблюдать 3-D топографии волокон и др.

6. Специфичность связывания нановолокон с анти-IgE DNP белка

1. Приготовить раствор из 4 мкг / л флуоресцентно меченые, FITC-IgE (флуоресцеин Isothio-цианата-иммуноглобулина Е) в PBS-BSA (фосфатно-солевой буфер, бычий сывороточный альбумин) решение.
2. Поместите кусочек кремниевой пластины, на которой находятся нановолокон на покровное Маттек хорошо. Инкубируйте нановолокон в этом растворе в течение одного часа. Инкубационный делается осторожно пипеткой из, 10 ул IgE раствора на кремниевой пластине.
3. После инкубации удаления несвязанного IgE промыванием образца в три раза с PBS-BSA буферный раствор. Решение PBS распределяется мягко на стене блюдо Маттек, чтобы избежать брызгали буфера непосредственно на нановолокон. Swirl блюдо аккуратно от руки, распространять буферного раствора на нановолокон. Осторожно снимите буфер с помощью пипетки и повторноторф этого еще два раза.
4. Для контроля, инкубировать нановолокон в флуоресцентно меченые IgG (неспецифическим для DNP) при тех же условиях.
5. Визуализируйте связанных волокон с конфокальный микроскоп для наблюдения связывания с IgE. Для нашего исследования, микроскоп был использован Leica TCS конфокальной SP2 с 63x объективом.

7. Вольт-амперная поведение нановолокон

1. Подключите два микро позиционеры до очень низкого источника тока, как Keithley 6430 чувствительной SourceMeter. Создана для определения текущего поведения напряжения показан на рисунке 3. Этот рисунок показывает Probe станции используются для определения начальных характеристик IV нановолокон. Она состоит из Bausch & Lomb и MicroZoom микроскоп, этап Вакуумная Чак, и четыре Micropositioners использованы при зондировании. В правом верхнем углу находится Agilent 34405A цифровой мультиметр, используемых для измерения напряжения и ниже, что является Keithley 6430 Sub-Femtoamp удаленного источника метр используется для источника низких токов, которые были введены в волокнах.
2. Измерительный зонд оружия микро позиционеры по волоконно-мата на противоположных сторонах кончиками касаясь волокон.
3. Подключить еще два микро позиционеры для цифровой мультиметр, установить зонд оружия в период между двумя другими и посадить советы на слой мата. Убедитесь, что все четыре советы, как коллинеарных насколько это возможно.
4. Входное переменное количество тока от Keithley (как правило, в диапазоне nanoamps).
5. Измерьте падение напряжения на внешнем советы, за каждую величину тока источников.
6. Построение этих значений будет указывать на тип устройства, волокнистый мат действует как.

8. Представитель Результаты

Функциональные полимерные

"> Метод синтеза α, ω-би [2,4-динитрофенил капроновой] [поли (этилен оксида)-б-поли (2-метоксистирол)-б-поли (этилен оксида)] (CDNP-ПЭО- P2MS-ПЭО-CDNP) показан на рисунке 4. ¹ Структура функционального полимера было подтверждено ИК-Фурье (рис. 5) и 500 МГц ¹ H ЯМР-спектроскопии (рис. 6). FT-IR показывает полное исчезновение -ОН широкими поглощения около 3500 см ^-1 указывает количественное функционализации с группой CDNP. Это также подтверждается ЯМР-спектр показан на рисунке 6. Используя интеграцию пиков в спектре ЯМР, было установлено, что CDNP-ПЭО -P2MS-ПЭО-CDNP полимеров количественно функциональными.

Нановолокон

На рисунке 7 мата проводящих нановолокон получить электропрядения CDNP-ПЭО-P2MS-ПЭО-CDNP / полистирол / ОУНТ из хлорбензола шсобственные. Конфокальной изображения, полученные показали, что белок IgE связывается с DNP на поверхности волокон. ³ Это свидетельствует о специфичности связывания Electrospun DNP-полимеров к антител IgE. Интенсивность света является показателем наличия IgE на нановолокон, как белка флуоресцентно помечены.

Рисунок 8а АСМ (атомно-силовой микроскоп) изображение одного нановолокон, полученные этим процессом и рис. 8, б показывает размер данного нановолокон составляет около 150 нм в диаметре. С помощью этого процесса волокна между 100-700 нм получены. При этом текущее время она является сложной задачей для подготовки волокон с определенной размерностью. Это согласуется с тем, что наблюдается в других группах. ⁴ Рисунок 9 показывает, СЭМ изображения CDNP-ПЭО-P2MS-ПЭО-CDNP / полистирол / ОУНТ нановолокон и диаметра нановолокон были от 200 нм до 300 нм. Существуют три SEM изображениями nanofibeRS показан при различных увеличениях. Исследование три изображения показывают морфологии волокон являются линейными и бисером. Общая цель заключается в подготовке волокон, которые в основном линейный. Рисунке 10 показана зависимость IV матов из нановолокон, приготовленный из CDNP-ПЭО-P2MS-ПЭО-CDNP / полистирол / ОУНТ. Из графика видно, поведение резистор (омических). Когда антиген связан с нановолокон, мы ожидаем увидеть изменение в поведении IV волоконного мата, так как это изменение сопротивления является характеристикой, которая предполагает, что функциональная волокна имеют потенциал применения в качестве активного компонента в датчики для обнаружения одной молекулы .

Рисунок 1. Реакторе полимеризации для синтеза α, ω-dihydroxyl полимера. A) точки впрыска для газа, азота UHP потока. Б) Инъекции точка для растворителя, мономера и инициатора. C) реакционный сосуд.

Рисунок 2. Установки используются для электропрядения использованием Глассман источника высокого напряжения.

Рисунок 3. Установки для измерения IV участках использованием Sub-femtoamp удаленного SourceMeter (Keithley).

Рисунок 4.). Синтетический подход к подготовке OH-ПЭО-P2MS-ПЭО-OH полимеров. B) Функционализация α, ω-дигидрокси [поли (этиленоксида)-б-поли (2-метоксистирол)-б-поли (этиленоксида)].

Рисунок 5. ИК-спектры (A) OH-ПЭО-P2MS-ПЭО-OH, предшественник CDNP-ПЭО-P2MS-ПЭО-CDNP и (B) CDNP-ПЭО-P2MS-ПЭО-CDNP.

Рисунок 6. 500 МГц Протон ЯМР CDNP-ПЭО-P2MS-ПЭО-CDNP.

Рисунок 7.) Привязка изображения FITC-IgE с CDNP-ПЭО-P2MS-ПЭО-CDNP волокон Electrospun из хлорбензола. B) конфокальной микроскопии изображение элемента управления (нановолокон с IgG).

Рисунок 8.) АСМ изображение CDNP-ПЭО-P2MS-ПЭО-CDNP волокна Electrospun из хлорбензола и B) АСМ-профиля т.е. размер одного волокна показано на рисунке 5а.

Рисунок 9. СЭМ изображения CDNP-ПЭО-P2MS-ПЭО-CDNP / полистирол / ОУНТ нановолокон.

Рисунок 10. IV участок коврики нановолокон, приготовленный из CDNP-ПЭО-P2MS-ПЭО-CDNP / полистирол / ОУНТ.

Обсуждение

В данном отчете мы представили мощный подход к подготовке биофункциональные нановолокон. Нановолокон оформлены на функциональную группу, которая относится к определенной модели белка. Порядок и подход сообщил в этой связи носит общий характер и может быть использована для получения ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге
Металлического натрия	Sigma-Aldrich	282065
Benzophenone	Sigma-Aldrich	239852
2-метоксистирол	Sigma-Aldrich	563064
Тетрагидрофуран	Sigma-Aldrich	178810
Хлорбензол	Sigma-Aldrich	319996
Однослойных УНТ	Sigma-Aldrich	704113
Полистирол	Sigma-Aldrich	81416
Кремниевые пластины	Кремний Quest Int'l	720200
Zeiss FESEM	Carl Zeiss Инк	Ultra 60
Probestation с Bausch & Lomb MicroZoom II Высокая производительность микроскоп	Bausch и Ломегабайт
Leica сканирующей конфокальной системы	Leica Microsystems	TCS SP2
Sub-femtoamp удаленного SourceMeter	Keithley Instruments	6430
Автоматический выбор диапазона цифровой мультиметр	Keithley Instruments	175A
Шприцевой насос	Chemyx Инк	Fusion 200
Zeiss Оптический микроскоп	Carl Zeiss Инк	Zeiss / Axiotech