Изготовление и использование микроокружения микрочипов (MEArrays)

Резюме

Комбинаторной функциональный метод скрининга для получения понимание воздействия молекулярного состава микросреды на клеточные функции описаны. Метод использует существующие микрочипов на основе технологии для создания массивов определены комбинаторной микросреды, которые поддерживают клеточной адгезии и функционального анализа.

Аннотация

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, distinct microenvironments can impose differentiation, migration, and proliferation phenotypes, and on the tissue level the microenvironment processes as complex as morphogenesis and tumorigenesis¹. Not only do the cell and molecular contents of microenvironments impact the cells within, but so do the elasticity² and geometry³ of the tissue. Defined as the sum total of cell-cell, -ECM, and -soluble factor interactions, in addition to physical characteristics, the microenvironment is complex. The phenotypes of cells within a tissue are partially due to their genomic content and partially due to the combinatorial interactions with the microenviroment. A major challenge is to link specific combinations of microenvironmental components with distinctive behaviours.

Here, we present the microenvironment microarray (MEArray) platform for cell-based functional screening of interactions with combinatorial microenvironments⁴. The method allows for simultaneous control of the molecular composition and the elastic modulus, and combines the use of widely available microarray and micropatterning technologies. MEArray screens require as few as 10,000 cells per array, which facilitates functional studies of rare cell types such as adult progenitor cells. A limitation of the technology is that entire tissue microenvironments cannot be completely recapitulated on MEArrays. However, comparison of responses in the same cell type to numerous related microenvironments, for instance pairwise combinations of ECM proteins that characterize a given tissue, will provide insights into how microenvironmental components elicit tissue-specific functional phenotypes.

MEArrays can be printed using a wide variety of recombinant growth factors, cytokines, and purified ECM proteins, and combinations thereof. The platform is limited only by the availability of specific reagents. MEArrays are amenable to time-lapsed analysis, but most often are used for end point analyses of cellular functions that are measureable with fluorescent probes. For instance, DNA synthesis, apoptosis, acquisition of differentiated states, or production of specific gene products are commonly measured. Briefly, the basic flow of an MEArray experiment is to prepare slides coated with printing substrata and to prepare the master plate of proteins that are to be printed. Then the arrays are printed with a microarray robot, cells are allowed to attach, grow in culture, and then are chemically fixed upon reaching the experimental endpoint. Fluorescent or colorimetric assays, imaged with traditional microscopes or microarray scanners, are used to reveal relevant molecular and cellular phenotypes (Figure 1).

протокол

1. Подготовка Печать Субстраты

Решение об использовании полидиметилсилоксана (PDMS)-покрытием или полиакриламида (ПА)-покрытием слайды зависит от важных параметров эксперимента. Модуль упругости обоих полимеров может быть настроен для имитации жесткости различных тканей, изменяя базовый / лекарство отношение PDMS, и акриламид / бис-акриламида отношение PA. PDMS может имитировать жесткой ткани в пределах 1-10 МПа (например, хрящей, роговица, и артериальной стенки), П. могут имитировать мягкие ткани в диапазоне от 100 Па-100кПа (например, молочной железы, мозга, печени и простаты) ^5. PDMS недороги, просты в приготовлении и геометрии печатной функции будут идентичны главе печати контактов. Таким образом, размер и форму особенностей можно точно управлять с помощью булавки с различной геометрией чаевых. PDMS является более гидрофобным, чем ПА, которое вызывает некоторые проблемы при обращении с клеткой и immunosсодержащего шаги, и могут быть несовместимы с некоторыми клеточными линиями. Потому что ПА является гидрогель и родных, не загрязнение поверхности, клетки будут только придают местах, где есть белки, которые адгезии поддержка клетки. Геометрия печатных особенности на гели PA точно не следовать геометрии булавочную головку, обычно они становятся кругов за счет диффузии, независимо от геометрии булавочную головку, которая используется. Печать контакт параметры времени и контактных диаметра могут быть определены эмпирически для оптимального размера функцию гели PA.

Полидиметилсилоксана (PDMS)

1. В одноразовые пластиковые чашки объединить Sylgard 184 силиконового эластомера базы с отвердителем в соотношении 10:1, смешать энергично с деревянным или пластиковым шпателем, то дегазацию в вакууме комнатной температуре в колокол в течение 30 мин.
2. Центр стандартных стекло микроскопа на вакуумном приводом патрон спина нанесения покрытия, то дождь 0,5 мл смешанного полимера эластомера на центр поверхности скольжения. Спина в6000 оборотов в минуту в течение 60 сек.
3. Лечение PDMS покрытием слайды в 70 ° C духовке или на плите цифровые (защита от пыли) в течение 4 часов в течение ночи.
4. Обработанная слайдов можно использовать сразу или хранить в течение нескольких месяцев в режиме слайд-бокс, который запечатан в пластиковый мешок Ziploc и хранится в ящике. PDMS притягивает пыль, поэтому он должен быть хорошо защищен от номера циркуляции воздуха.
5. Примечание: нитрил или других не-латексные перчатки необходимо надевать при работе с комплектом эластомера PDMS. Случайный контакт с латексными перчатками будет препятствовать PDMS полимеризации.

Полиакриламида (PA)

6. NaOH травления: Место слайдов на нагревательный блок при температуре 80 ° C. Добавить 1 мл 0,1 N NaOH на каждом слайде, убедившись, чтобы покрыть всю поверхность слайда. Пусть NaOH испаряться (белая пленка должна формироваться на поверхности скольжения). Поскольку гель PA можно подключать только твердо стоит на NaOH поверхности травлением, гель ПА оторваться во время высыхания шаг, если все прибоя слайдТуз не распространяется на NaOH. Если слайд поверхность не была покрыта полностью, повторить добавлением 1 мл 0,1 N NaOH. Слайды можно хранить при комнатной температуре (RT) в течение нескольких дней. Примечание: альтернатива травление NaOH является озон-или плазменный очистки слайдов.
7. 3-Аминопропилтриэтоксисилан (APES) покрытие: в вытяжной шкаф, место слайды в 15 мл блюдо и добавить 300 мкл APES на каждом слайде NaOH травлению. Пусть APES вступают в реакцию с NaOH скользит в течение 5 мин. Превышение этого времени будет вызывать трудности в вымывания непрореагировавшего реагента обезьян. Промыть тщательно APES деионизированной водой два-три раза по обе стороны горки. Если стиральная не является полным, APES будет окисляться Глутаральдегид, чтобы сформировать коричневые отложения на слайдах в шаге 1.8.
8. Глутаральдегид окисления: Аспирируйте все решения из слайд поверхности. В каждой 15 см блюдо, добавить 25 мл 0,5% глутаральдегида в PBS. Реакция в течение 30 мин в темном месте. Через 30 мин аспирации всех глутаральдегида и использовать не что-нибудь вкусненькое трудаAtory салфетки (например, Kimwipes) тщательно высушить слайдов. Слайды можно хранить при комнатной температуре в течение одного дня.
9. Гель подготовки: После приготовления смеси, в ​​том числе PA акриламида, бис-акриламида и DDH ₂ O в соответствии с таблицей, приведенной ниже, дегазацию в течение 30 мин, а затем поместить PA смеси на лед, чтобы замедлить полимеризацию. Добавить APS и TEMED и хорошо перемешать право, прежде чем гели. Внесите PA смеси на поверхности слайда и место 24 мм х 50 мм, номер 1 покровные на вершине PA. Избегайте нажатия и покровное стекло вместе и избежать образования пузырьков. Для гелей> 40000 Па использовать 100 мкл, для других гелей использовать 350 мкл.

Желаемый модуля (Pa)	Акриламид%	Бис-акриламида%	Акриламида с 40% акций (мл)	Бис-акриламида с 2% акций (мл)	Деионизированной воды (мл)	APS (мкл)	TEMED (мкл)
480 ± 160	3	0,06	0,75	0,3	8,95	100	10
4470 ± 1190	5	0,15	1,25	0,75	8	100	10
40400 ± 2390	8	0,48	2	2,4	5,6	100	10

Адаптировано из ^6,7.

10. Пусть гель PA полимеризоваться в течение 2 часов, а затем удалить покровные под деионизированной воды.
11. Вымойте слайды PA геля в больших Coplan банки в воде на ночь (~ 8 часов) для удаления непрореагировавшего акриламида.
12. Сухие слайды в духовку на 37 ° C в течение 2-4 часов или пока PA гель затвердевает полностью.
13. PA гель-слайдов можно хранить при температуре 4 ° C в течение одного месяца в запечатанной коробке слайд.

2. Белки Master плиты подготовка

1. Все белки ShoulD на аликвоты в акции 10X решений в буфер рекомендованных поставщиков и хранить при температуре -80 ° C. Большинство белков ECM растворимые в деионизированной воде, но рН может нуждаться в корректировке с капель уксусной кислоты. Большинство факторы роста, цитокины и рекомбинантный рецептор внеклеточных доменов готовятся в PBS с BSA, но производитель условия будут меняться. Фильтр белка аликвоты через 0,45 мкм 4-мм нейлоновый фильтр шприца (Nalgene) перед хранением.
2. Разработка мастер пластины в соответствии с желаемой комбинации белков и разведения. Приверженец клетки обычно полагаются на присутствие хотя бы одного совместимого ECM посредником клеточной адгезии, но антитела к эпитопам клеточной поверхности может также посредником привязанность иногда. Это хорошая идея, чтобы добавить свободного красителя FITC или fluorphore конъюгированных белков по крайней мере одного хорошо, так что массивы могут быть легко ориентированных позже.
3. Подготовка мастер пластины путем разбавления белка комбинации с печатью буфере, состоящем из 100 мМTris-acetate/20% glycerol/0.05% Triton-100X рН 5,2. Обычно каждую лунку 384-луночный планшет содержит не более 10 мкл.
4. Запишите содержимое каждой лунки в каждом мастера пластины в табуляцией файл базы данных и предоставлять каждому мастеру пластины с уникальным идентификационным номером. Шестизначный даты следуют инициалы дизайнера часто служит цели (MMDDYYinitial). Потому и объемы небольшие, белка аликвоты могут быть эффективно использованы для создания большого числа повторных пластин. Рекомендуется, чтобы мастер пластины хранятся при температуре -80 ° C и каждый мастер пластина должна пройти не более двух циклов замораживания-оттаивания.

3. MEArray печати

1. MEArrays могут быть напечатаны с самым обычным роботам микрочипов печати. Quill контактных принтеров, которые используют либо силикон или нержавеющей стали контакты хорошо работать, но белка вязкости может быть проблематичным. Капиллярная принтеры идеально подходят микрочипов печати роботов для этого приложения, как они работаютНу с вязкие растворы белка.
2. Для достижения хороших статистических власти в пределах массива, от 10 до 12 повторных пятна каждой микросреде рекомендуется. Такая конструкция позволит сравнения деятельности в одной микросреде по отношению к другой в одном массиве с помощью простых Т-тест статистику. Тест Dunnette может быть использована для сравнения деятельности в контрольной среде с другими микросреды. Эта конструкция работает лучше, когда функциональный фенотип был связан с контролем микросреда, прежде чем выполнять MEArray экспериментов.
3. Влажность воздуха должна поддерживаться около 50%. Контроль влажности важна потому, что низкая влажность может высушить раствор внутрь или контакта в скважинах мастер пластины вызывает неэффективное осаждения на печать субстратов. Влажность можно управлять эффективно, драпировки робота с непористых полиэтиленовую пленку и с использованием как увлажнитель и де-увлажнитель с целью поддержания влажности 50%. Охлажденный plattens печать может быть USEFулица для сохранения некоторых белков, но осторожность должны быть приняты, чтобы избежать образования конденсата на слайдах.
4. Каждый печатный массива должны быть маркированы с морозильником-доказательство слайд этикетки, закодированные с серийным номером, который состоит из идентификатора пластины мастера следует трехзначное число (MMDDYYinitial-NNN). Как и каждый массив использоваться или распространяться, сведения о их экспериментальной процедуры должны быть сохранены в базе данных. Отслеживание даты печати и количество циклов замораживания-оттаивания мастер пластины поможет определить оптимальные условия для сохранения воспроизводимости.
5. Печатные MEArrays должны храниться в запечатанных коробках слайд при -20 ° С в течение не более одного месяца. Воспроизводимость заметно снижается после этого.

4. Культивирование клеток млекопитающих на MEArrays по функциональному анализу

1. Прикрепить культуры камер: Для ограничения объема информации и количества необходимых клетке культуры на MEArrays, пластиковые камеры Fitted, чтобы окружить печатных массива. Для многих массивах, одну камеру с 2-х камерный слайд (Nunc), который содержит площадью 4,2 см ² может быть использован. Удалите из камеры промышленные слайд камеру и сократить камер в половине с лезвием бритвы. Используйте 3 мл шприца нанести тонкий валик аквариума силикона (DAP) к краю камеры и нажмите на поверхность MEArray. Избегайте применять камеру аквариума силикона на массиве возможности.
2. Блокировка и промывка: MEArrays должны быть хорошо промыты, чтобы удалить непрореагировавшие мономеры, которые могут быть токсичными для клеток. Если PDMS покрытием слайды были использованы, то в регионах между печатной особенности в первую очередь необходимо быть заблокирован без загрязнения покрытия для предотвращения клеточной адгезии; инкубировать массивов в 1% Pluronic F108 (BASF) в воде или 2% BSA в воды в течение 15 мин под вакуумом. PA гель слайды не требует блокировки шаг. Во всех случаях, промыть массивы со средствами массовой культуре клеток в три раза в течение пяти минут (СМИ выбор зависитна клетки используются, но использование антибиотиков рекомендуется независимо от средств массовой информации или клеток). PA гели требуют дополнительных 30 мин инкубации в среде, увлажняет гель.
3. Сотовые крепления: Четыре-пять массивов может поместиться внутри одного 15 см стерильной чашке Петри. Накройте чашку Петри с крышкой, чтобы сохранить массивы стерильной. Добавить половину конечного объема средств массовой информации MEArray путем добавления ячеек в СМИ, чтобы конечная концентрация 10000 до 1000000 кл / мл. Клетки будет приложить к печатному функции с разной скоростью в зависимости от состава печатных микроокружения. Проверьте равномерное вложение при просмотре массивы через перевернутый столик микроскопа от 15 до 20 минутные интервалы. По осторожно встряхивая MEArrays вперед и назад, клетки крепления в узорной образом можно отличить от плавающего, одиноких клеток.
4. Удаление несвязанных клеток: на PA-покрытием MEArrays, свободные клетки могут быть атмосферный и средства массовой информации может быть заменен на соответствующий объем. На PDMS-покрытием MEArrays, средства массовой информации никогда не может быть полностью удалены из колодца, потому что клетки высыхают и умирают почти сразу. Таким образом, на PDMS покрытием MEArrays, свободные клетки должны быть удалены процесс последовательного обмена половину объема средств массовой информации до несвязанного клетки удаляются, как это определено микроскопического осмотра. Де-эффект смачивания PDMS менее заметным, когда содержащей сыворотку средства массовой информации используются по сравнению с среде, и, когда BSA используется для блокировки непечатаемое районах по сравнению с Pluronics F108.
5. Клетки можно культивировать на MEArrays помещен 15 см чашки Петри в течение многих дней с нормальной смены носителя. Медиа изменения на слайдах PDMS должно быть сделано с последовательным изменением половины объема средств массовой информации.
6. Общие фиксаторов, таких как параформальдегидом и метанола / ацетона, совместимых с системами MEArray. При окрашивании клеток на PA-покрытием MEArrays, фиксаторы могут быть добавлены и смыл так же, как они были бы в обычной процедуре окрашивания.Однако, когда окрашивания клеток на PDMS покрытием MEArrays, поверхность должна оставаться влажными даже во время фиксации. Аспирируйте половины средств массовой информации и замену с фиксатором. Повторите процедуру несколько раз, пока скважина заполнена большинство фиксатором. После фиксации фиксатора постепенно сменяется таким же образом, блокирующим буфером, который подходит для следующего шага анализа.
7. Иммуноокрашивание обычно используется для анализа клеточных функций. Окрашивание подпрограммы будет меняться, но при работе на MEArrays PDMS, нужно выполнять каждый мойки и стремление шаг, как и выше, постепенно изменяя решения и никогда не позволяя поверхности де-влажный. Де-смачивание приведет к артефактам в окрашивании.
8. Камеры могут быть удалены при помощи лезвия бритвы. Покровные может быть установлен на верхней части окрашенных MEArrays использованием Fluoromount-G (Southern Biotech). Обнаружение может быть выполнена с наиболее многоцветной флуоресценции сканеры микрочипов или на конфокальный микроскоп с моторизованнымкафельной режимов захвата изображений.

5. Представитель Результаты

Например осаждения белков по образцу печатной PDMS-плыли MEArray использованием квадратных наконечником кремния контакты на перо контактных микрочипов печати робот показано на рисунке 2. Нанесение различных белков, которые печатаются может быть проверена с помощью иммунофлуоресценции с использованием антител (рис. 2A). Растворы белковых растворов в мастер пластины отражают суммы (интенсивность флуоресценции), которые осаждаются на поверхности субстрата печати (рис. 2В). Клетки должны приложить к печатному возможности очевидны узорные образом (рис. 2).

Пример MEArray эксперимент, показывающий, что обратное разведения двух белков микроокружения вызвали конкретные профили экспрессии кератина в концентрации белка-зависимым образом в человеческом мультипотентных молочной эпителиальных рrogenitor клеточной линии (D920 клеток), показана на рисунке 3. Bubble участков полезны для определения того, конкретные фенотипы предъявляются клеток на повторных особенности разведения серии. Например, если конкретная молекула в микросреде вызывает отдельный фенотип, как только поучительные компонент был разбавлен достаточно в фоне нейтральной ECM фенотипа должно измениться или исчезнуть. Иммунофлуоресценции обнаружения кератина 8 и кератина 14 промежуточных белков нитью проводилась с Axon 4200a (Molecular Devices) микрочипов сканера. Двенадцать повторных серий разведения были напечатаны на каждом MEArray, и журнал _{2 Отношение} кератина 8 до 14 кератина средней интенсивности флуоресценции была графически в виде пузыря участок, чтобы дать реальное представление о вариации и воспроизводимости сигнала. Показана данных из MEArray, который был зафиксирован после того, как клетки были прикреплены и несвязанных клеток были смыты водой (рис. 3А), и после 24 ч cultuRe (рис. 3В). Для этого сравнительно небольшого анализа, однофакторного дисперсионного анализа была использована для определения отклонения от среднего сигнала в каждый момент времени, и сгруппированы двусторонний T-тесты были использованы для определения различных разведений типа я коллагена и рекомбинантный человеческий P- кадгерина вызвано изменениями в кератина выражения. Существовал не отклонение от среднего между клетками на особенности сразу после вложения, однако существуют значительные различия в кератина выражения среди клеток после 24 часов воздействия различных микросреды. T-тесты подтвердили, что высокие типа я коллагена концентрации вызывали выше кератина 8 выражении, в то время как высокие P-кадгерина концентрации вызвало сильное кератина 14 сигнала после 24 часов. Этот результат согласуется с предыдущими докладами, что Р-кадгерина содержащих микросреды будет навязывать из K14-экспрессирующих фенотип миоэпителиальных на би-сильный молочных клеток-предшественников ^4.

Пример целой scanneг MEArray напечатаны на 40000 Па Па гель показано на рисунке 4.

Рисунок 1. Блок-схема процедуры MEArray. Во-первых, печать субстраты готовят либо с PDMS или PA. Во-вторых, мастер пластин готовы и аннотированные в базе данных. В-третьих, MEArrays печатается и кодируется с серийными номерами. В-четвертых, культура камеры присоединены, поверхностей блоков и / или промыть, затем клетки могут приложить и несвязанных клеток вымываются. В-пятых, клеток можно лечить с помощью окрашивания или био-тест после периода инкубации на основе эксперимента. Наконец, изображения MEArray может быть получена и проанализирована с подходящим сканером и программным обеспечением.

Рисунок 2. Депозиты вition и относительное обилие печатных белков можно проверить с помощью иммунной до прикрепления клеток. A) Антитела, которые признаны IV типа коллагена и ламинина-111 были использованы для проверки их присутствие в печатных особенности MEArray. Б) с помощью средней интенсивности пикселей анализ функции в NIH ImageJ программного обеспечения, относительное содержание двух белков через серию разведений, начиная с 200 мкг / мл раствора белка, можно качественно оценить. C) Этап микрофотография D920 клеток, прикрепленных к квадратной особенности печатного PDMS покрытием MEArray.

Рисунок 3. Пример MEArray анализа с использованием изменений в кератин выражение в мультипотентных линии клеток-предшественников, как функции времени и микросреды. Каждый пузырек представляет соотношение кератина 8 и 14 кератина белка от 10-15 клеток, прикрепленных к осотемпература в MEArray. Выражение было определено с иммунофлуоресцентного зондов. A) показывает соотношение кератина в клетках сразу после вложения и B) показывает, кератин отношения после 24 часов на массиве, который помещали в параллель. Максимальная концентрация обоих белков составляет 200 мкг / мл и разбавляют в 2 раза. Диаметр пузырька представляет величину журнал _{2 Отношение} кератина 8 и кератина 14 средней интенсивности, а оранжевый и белый цвета кодирования указывает значения> 0 и <0, соответственно. F-значения для одностороннего ANOVA и P-значения из T-тестов, а также скобки со стрелками выявлении среди населения по сравнению, показаны.

Рисунок 4. Пример MEArray сканирования, приобретенный с помощью кафельной режиме сбора на лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. HCC1569 клеток мы позволили включить ДНК аналоговых образования в течение 4 ч до фиксации.DAPI (синий) и образование (красный) показаны.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

MEArray метод, представленный здесь дает функциональный анализ клеточных взаимодействиях и комбинаторной микроокружения ^4. MEArray анализ сочетает в себе использование базовых технологий micropatterning, клеточной биологии, и микрочипов печати роботов и анализ устройств, которые доступны на...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
Предметные стекла 25 мм х 75 мм	VWR	48311-600
Стекло покровные (№ 1) 24 мм х 50 мм	VWR	48393-241
Окрашивание блюдо (или Coplan банку)	VWR	25461-003
Чашки Петри (15 см)	BD Falcon	351058
NaOH (1,0 н)	Sigma-Aldrich	S2567
APES (> 98% (3-аминопропил) триэтоксисилана)	Sigma-Aldrich	A3648
Глутаральдегид	Sigma-Aldrich	G7651	50% в воде
APS (> 98% персульфата аммония)	SIGMA-Aldrich	A3678	Подготовить 10% рабочего раствора с DDH 2 O
TEMED (N, N, N ', N'-тетраметилэтилендиамин)	Sigma-Aldrich	T9281
Акриламида (40%)	Sigma-Aldrich	A4058
Бис-акриламид (2% вес / объем)	Фишер BioReagents	BP1404-250
0,45 мкм шприц фильтр 4-мм нейлон	Nalgene	176-0045
FITC	Sigma-Aldrich	F4274
PDMS (полидиметилсилоксан)	Dow Corning	3097358-1004	Sylgard 184 Эластомер комплекта через Клеи Ellsworth
2-х камерный слайды	NUNC	177380
Pluronic F108	BASF	30089186
AquArium герметика	Dow Corning	DAP 00688
Fluormount-G	Southern Biotech	0100-01
Одноразовые пластиковые стаканчики
Язык депрессоров
Нитриловые перчатки
Пластиковые боксы стекло микроскопа
Спин для нанесения покрытий	WS-400B-6NPP/LITE	Laurell Technologies Corporation
Печь
Цифровой плиты
384-луночных планшетов			Совершенно подходит для робота микрочипов
Microarray печати робот
Перевернутый фазы и флуоресцентного микроскопа
Axon микрочипов сканеры	Molecular Devices		Несколько конфигураций существуют