Измерение антител воздействие на клеточные функции кардиомиоцитов изолированного

Резюме

Представленный метод предлагает способ определения функционального эффективной кардиотропной аутоантител в плазме пациентов с дилатационной кардиомиопатией, независимо от специфического антигена, анализируя влияние изолированного иммуноглобулина пациента на клеточном сокращения и внутриклеточного кальция в переходных изолированные кардиомиоцитов крысы.

Аннотация

Дилатационная кардиомиопатия (DCM) является одной из основных причин сердечной недостаточности у молодых взрослых ^1. Хотя генетическая предрасположенность и экспозиции воздействию токсичных веществ известны причины этого заболевания примерно у одной трети пациентов, происхождение DCM остается во многом неясной. В Значительное число этих больных аутоантител против сердечных эпитопы были обнаружены и, как предполагается, играют ключевую роль в возникновении и прогрессировании заболевания ^2,3. Важность сердечного аутоантител подчеркивается улучшение гемодинамики наблюдается в DCM пациентам после удаления аутоантител к иммуноадсорбции ^3-5. Различные специфические антигены уже определены ^2,3 и антитела против этих целей могут быть обнаружены с помощью иммуноанализа. Тем не менее, эти методы не могут различать стимулирование (и, следовательно, функционально эффективными) и блокирование аутоантител. Там растет Доказательство томсе, что это различие имеет решающее значение ^6,7. Можно также предположить, что цели для ряда кардиотропной антитела еще неизвестные и поэтому не могут быть обнаружены с помощью иммуноанализа. Таким образом, мы создали метод для выявления функционально активных кардиотропной антител, независимо от их соответствующим антигеном. Фон для метода является высокая гомология обычно наблюдаются функциональные области сердечной белков между млекопитающими ^8,9. Это означает, что сердечные антител, направленных против антигенов человека будет перекрестно реагируют с не-человека клетки-мишени, которая позволяет тестирование IgG у пациентов DCM на взрослых кардиомиоцитов крысы. Наш метод состоит из 3 шагов: во-первых, IgG изолирован от пациента плазмы с помощью сефарозы связанных анти-IgG антител, полученных из столбцов иммуноадсорбции (PlasmaSelect, Teterow, Германия). Во-вторых, взрослые кардиомиоциты выделяют коллагеназы перфузии в аппарат Лангендорфа перфузии Использование AProtocol изменения от предыдущих работах ^10,11. Полученные кардиомиоциты, которые прикреплены к ламинин покрытием камерных coverglasses и окрашивали Фура-2, кальций-селективный флуоресцентный краситель, который может быть легко приведена в клетке для наблюдения внутриклеточного кальция (Ca ^{2 +)} содержание ^12. В последнем шаге, эффект от пациента IgG на сокращение клеток и Ca ^{2 +} переходных полей стимулировали кардиомиоцитов контролируется в Интернете с помощью коммерческих миоцитов кальцием и сократительной системы мониторинга (IonOptix, Милтон, Массачусетс, США), подключенный к стандартному обратный флуоресцентный микроскопом.

протокол

1. IgG Изоляция от образцов пациентов

1. Подготовить мини-иммуноадсорбции столбцов, заполняя 3 мл анти-IgG сефарозе в 2 мл ЭДТА плазма пациента в пустую колонку Econo Pac. IgG изоляции требуется по меньшей мере 2 мл плазмы пациента.
2. Поместите фильтр в верхней части анти-IgG сефарозе, разрезать нижний кончик колонке и нажмите фильтра для достижения скорости потока примерно 1 капля / сек. Пусть сохранение решение бежать из колонны.
3. Промойте колонку с 3-х томах 0,9% NaCl в объеме плазмы.
4. Внесите плазмы на колонку. Когда плазма полностью погружен в анти-IgG сефарозе, мыть при том же объеме 0,9% NaCl.
5. Внесите один плазменный объем 0,2 М глицин HCl, рН 2,8 на колонке, и пусть погрузиться в сефарозе. Добавить другой объем глицин HCl на колонку. Сбор потока через в 15 мл трубки и регулирования рН до 7,3 с 0,5 М Трис-HCl, рН 8,0.
6. Для регенерации колонки, Промывают 3 плазменных объемов глицин HCl. После окончательной промывки 2-х томах 0,9% NaCl, колонка может быть использована для следующих образцов плазмы. Кроме того, колонка может быть заполнена с сохранением решение и хранить при температуре 4 - 8 ° C в течение 4 недель.
7. Для использования на кардиомиоциты, доля собранных IgG должен быть диализу против экспериментальных буфера (EB). Для подготовки EB, добавить 117 мм NaCl, KCl 2,8 мм, 0,6 мм MgCl _2, 1,2 мМ KH ₂ PO _4, 1,2 мМ CaCl _2, 10 HEPES мм и 20 мм глюкозы в 1 л дистиллированной воды на магнитной мешалкой и регулирования рН до 7,3.
8. Заполните фракции IgG к диализу целлюлозы трубку мембраны эфир с молекулярной массой отрезаны от 100 кДа. Положите трубку в 1 л EB и помешивать с магнитной мешалкой при температуре 4 ° C. После 8 часов, передает диализа трубки в 3 л свежего EB и диализ в течение еще 20 ч при 4 ° C.
9. После диализа, тепло образца в течение 30 мин при 57 ° C на водяной бане до inactivatмножители е дополнение. Определение общей концентрации IgG и подготовить аликвоты, содержащий 330 мкг IgG каждого. При добавлении образца в кардиомиоциты для измерения (шаг 4,3), заполнить аликвоты по 1 мл EB. Неразбавленный аликвоты могут храниться при температуре от -20 ° C до дальнейшего использования.

2. Выделение кардиомиоцитах крысы

1. Для подготовки Ca ^{2 +-бесплатное} выделение буфера (IB), добавить 110 мМ NaCl, 2,6 мМ KCl, 1,2 мМ MgSO _4, 1,2 мМ KH ₂ PO _4, 20 HEPES мм и 11 мм глюкозы в 1 л дистиллированной воды с помощью магнитного мешалкой. Отрегулируйте рН до 7,4 при комнатной температуре и процеживают через 0,2 мкм бутылку топ фильтр для стерилизации.
2. Заполнить 80 мл IB в верхнем резервуаре термостатировали системы перфузии Лангендорфа. Отрегулируйте настройки термостата для поддержания буферной температуре 37 ° C и проветрить буфер с 95% O _2/5% CO ₂ в течение 30 мин.
3. Взвешивание приблизительно 10.000 - 12.000 U из collagenase типа II, 175 мг жирных кислот BSA и растворить в 20 мл IB содержащий 22,5 мкл 100 мМ CaCl ₂ раствора. Контроль рН выделения буфера в верхний резервуар и корректировать при необходимости.
4. Анестезировать крыс Вистар в 175 - 200 г с 375 мкг / кг тиопентала массы тела. Добавить 2500 МЕ гепарина в тиопентала решение. После торакотомии, акцизы сердце тщательно с неповрежденным дуги аорты и передать его в ледяную 0,9% NaCl. Очистить сердце от крови и окружающих тканей и передачи на свежий 0,9% NaCl. Предоставление доступа к аорте, открыть поток редуктора системы Лангендорфа чтобы получить падение скорости 2-3/sec и приложить сердце к канюлю.
5. Заливать сердца на срок до 3 мин при скорости потока 1 капля / сек, чтобы смыть оставшиеся крови. Начало распространить IB в системе Лангендорфа. Удалить 20 мл буфера из верхнего резервуара, заполните решение коллагеназы и пополнить столько буфер, необходимых для достижения 80 мл. Распространить с ollagenase решение еще 27 мин. Скорость потока должна контролироваться периодически и поддерживается на 1 капля / сек помощью потока редуктора.
6. Снимите сердце от канюли, очистить от предсердия и аорты и нарезать на мелкие кусочки. Разрешить коллагеназы решение бежать в нижний резервуар, уменьшите громкость до максимума 40 мл и далее переваривать нарезанный желудочков в течение 10 - 15 мин при непрерывной аэрации с 95% O _2/5% CO _2. После фильтрации суспензии клеток через 200 мкм, размер ячеи марлю в 50 мл трубки.
7. Восстановление Ca ^{2 +} содержание клеток в 3 этапа: центрифуги суспензию клеток на 43 мкг в течение 2 мин при комнатной температуре и ресуспендирования клеток в 10 мл IB, содержащей 200 мкМ CaCl _2. Центрифуга снова и ресуспендирования клеток в 10 мл IB с 500 мкМ CaCl _2. После окончательного центрифугирования ресуспендируют кардиомиоцитов в стерильной фильтрации EB (см. п. 1.8) до плотности 50000 клеток / мл.

e_title "> 3. Фура-2 Окрашивание кардиомиоцитов

1. Пальто 4 хорошо патрон покровного стекла с 10 мкг ламинина на лунку и подождите, пока он полностью высушен.
2. Заполнить 1 мл кардиомиоцитов подвески в каждую лунку помощью микропипетки с разрезом чаевых. Разрешить клетки придерживаться в течение 1 часа при комнатной температуре.
3. Развести 10 мкл 1 мг / мл Фура-2 утра раствор в 5 EB мл. Держите окрашивание раствора в темноте.
4. Снимите буфер и одинокие клетки покровного стекла и пипеткой 0,5 мл окрашивание раствора в каждую лунку. Инкубируйте клетки в течение 10 минут при умеренном встряхивании. Затем снять окрашивание раствора, промыть клетки один раз с 1 мл EB и, наконец, залить 0,5 мл EB в каждую лунку. Избегайте прямых солнечных лучей во время окрашивания процесса и всегда держать окрашенных клеток в темноте.

4. Запись сокращения клеток и Ca ^{2 +} переходных

1. Поместите покровного стекла камерные на обратную м флуоресценцииicroscope подключен к миоцитов кальция и сократимость записи. Разместите заказ электрод с притоком и отток трубки в первой скважины. Переливать кардиомиоцитов с 1 мл / мин EB и начать электрической стимуляции (20 В, 1 Гц, 5 мсек). Дайте клеткам адаптироваться к стимуляции в течение примерно 2 мин.
2. Выберите нетронутым стержень формы кардиомиоцитов с четким страты и постоянное сокращение. Поместите ячейку в центре поля зрения и открыть канал камеры. Ориентируйтесь ячейки по горизонтали в области видео, вращая адаптер ячейки каркаса и перемещения микроскопа.
3. Отрегулируйте края обнаружения элементов управления области видео (рис. 2), откройте флуоресцентного канала и запись 10 - 15 сокращений для получения начального сокращения клеток и Ca ^{2 +} преходяще.
4. Закрыть канал световой микроскоп, чтобы избежать обесцвечивания флуоресценции пятна. Переключение потока через от EB к образцуобход с 3-ходовой клапан и переливать кардиомиоцитов с 1 мл пациента IgG. Остановите насос перед воздуха достигает хорошо.
5. Откройте световой канал и одновременно записывать другую 10 - 15 сокращений, чтобы получить острую реакцию клетки. Для приостановки записи и закрыть световой канал снова. Повторить записи через 2 и 5 мин.
6. Выньте электрод хорошо. Очистка труб тщательно EB и переходите к следующему также из покровного стекла камерные.
7. Анализ сокращение клеток и Ca ^{2 +} переходные с IonWizard программного обеспечения с использованием "Edge-Length/Length» и «фура 2-числовых вычитается / Ratio" окна, соответственно. Вычислить процентное изменение от начального сокращения клеток и Ca ^{2 +} переходных высоты пика называется базовой (бл% пик ч) для острого, 2 мин и 5 мин ответ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Два примера для измерения сотовой инотропный эффект в области стимулировали взрослых кардиомиоцитов (рис. 2) с помощью миоцитов Са ^{2 +} и сократительной системы записи приведены ниже. Рисунок 3 дает представление о контрольных измерений, а на рисунке 4 эфф...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Представленный метод предлагает подходящий способ обнаружения функционально эффективными сердечными аутоантитела у больных с DCM неясного происхождения. По сравнению с другими методами, например, выявление функциональных активные антитела против β1-адренорецепторов их влияние ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента / оборудования	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
Immunosorba сохранение решение	Fresenius Medical Care	903609211
Коллагеназы типа 2	Сотовые системы	LS004176
BSA, жирных кислот	Sigma-Aldrich	A6003
Ламинин	Sigma-Aldrich	L2020
Фура-2 утра	Sigma-Aldrich	F0888	1 мг / мл в ДМСО
Econo Pac Хроматографические колонки	BioRad	732-1010
Spectra / Por Biotech эфиров целлюлозы диализа Membranэлектронной	Spectrumlabs	131417
4 хорошо Chambered покровного стекла	Nunc	155383
Миоцитов кальция и сократимость записи	IonOptix
IonWizard 6,0 ​​программное обеспечение для анализа	IonOptix