Glycan Профилирование Plant Cell стены полимеров с использованием Microarrays

Резюме

Техника называется C Omprehensive M Icroarray P Olymer профилирования (CoMPP) для характеристики растений гликанов клеточной стенки описано. Этот метод сочетает в себе специфичность моноклональных антител, направленных на определенный гликана-эпитопы с миниатюрной микрочипов аналитическая платформа, позволяющая показ гликана вхождения в широкий спектр биологических контекстах.

Аннотация

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)^1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.

Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall³. Furthermore, their composition is also modified during development¹, or in response to environmental cues⁴.

In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis⁵. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized ^4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types⁶. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained⁷. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.

Monoclonal antibodies (mAbs)^8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously^9,10,11.

Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 & 2)^10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems¹² and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

протокол

1. Коллекция тканей и подготовка

1. Соберите 100 мг сырого веса ткани растений (минимум 10 мг сухого веса) по крайней мере в трех экземплярах для каждой ткани интерес. Следующие шаги описывают подготовку клеточного материала стены из растительной ткани. В случае хранения тканей, нежелательного крахмал ферментативно удалены прежде чем приступить к добыче полимеров клеточной стенки, как описано выше ^13.
2. Однородный образцов в мелкий порошок с жидким азотом использованием Qiagen TissueLyser II, с 24 трубка наборы и 3 мм из карбида вольфрама бисером (30 Гц, 2 х 30 сек). Либо, если только несколько образцов обрабатываются, ступка и пестик используются.
3. Передача гомогенатах в 10 мл коническую пластиковых труб.
4. Подготовить материал клеточной стенки, промывая гомогенатах в 10 мл 80% об / об этанола при комнатной температуре и встряхиванием энергично в течение 2 мин.
5. Центрифуга образцов при 3500 мкг и отбросить супернатант. Повторите 70% этанола моет по крайней мере, три раза или до супернатант ясно, особенно для тканей, содержащих хлорофилл.
6. Выполнение последней промывки со 100% ацетона и оставляют гранулы, содержащие алкоголь нерастворимых остатков (AIR) в воздушно-сухом ночь.
7. Сито проб воздуха с 0,4 мм ² сетки для достижения штрафа, однородный порошок и для удаления крупных, плохо измельченные частицы, которые иногда остаются в гомогената.
8. Взвешивание 10 мг пробы воздуха в микропробирки, каждый из которых содержит 3 мм, стеклянная бусина, чтобы помочь перемешивания образцов.

2. Добыча Гликаны клеточной стенки

1. Пектины, и полимеры, связанных с пектины выделяются из образцов путем добавления 500 мкл 50 мкМ CDTA (рН 7,5) в каждой пробе.
2. Коротко вихревой трубы для обеспечения растворитель находится в контакте с образцом материала, а затем смешать помощью TissueLyser в течение 3 ч при 8 Гц.
3. Центрифуга образцов при 12000 мкг, тщательно галить супернатанты и хранить при 4 ° C.
4. Вымойте гранул в 1 мл деионизированной воды для разбавления и удаления остатков растворителя, вихрь и центрифуге при 13000 х г. Повторите этот шаг, не нарушая гранул и удалить всю жидкость из трубки, прежде чем переходить к следующему шагу.
5. Сшивка гликанов последовательно извлечены из оставшихся клеточной стенки гранул с 500 мкл 4 М NaOH с 0,1% м / NaBH4, используя ту же процедуру, описанную в шагах 2,1 - 2,4 для извлечения CDTA. NaBH ₄ добавляют к снижению альдегида (или кето) группы на сокращение конце полисахаридов с алкоголем тем самым предотвращая шелушение базе полисахаридов.
6. После центрифугирования надосадочную жидкость снова снимается, хранится при температуре 4 ° С, а осадки промывают два раза в деионизированной воде, прежде чем переходить к следующей добычи.
7. В качестве дополнительного шага, остаточная полимеры, такие как целлюлоза экстрагировали 500 мкл cadoxen (31% об / об 1,2-diaminoethane с 0,78 м CdO), используя ту же процедуру, как описано в пунктах 2.1 - 2.4. Кроме того, абсолютное целлюлозного содержание в оставшиеся гранулы можно определить с помощью уксусной / азотной анализов (см. обсуждение).

3. Печать Microarrays

1. Центрифуга супернатантов, содержащих извлеченные полимеров клеточной стенки при 13000 мкг для удаления твердых частиц.
2. Загрузите 50 мкл каждого образца в полипропилен 384-луночных планшет использованием заранее разработанных пользовательский макет, где образцы расположены в соответствии с типом ткани и добыча типа.
3. Развести клеточной стенки полимера образца в 0, 5 и 25 × последовательный ряд разбавления деионизированной воды.
4. Такие параметры, как высота контактный, сбор и время выдержки, и промывки устанавливаются на программное обеспечение управления microarrayer.
5. Влажность печати камере контролируется на 60%, чтобы предотвратить испарение образца.
6. Задание печати начали использовать LabNEXT SoftwaRe и программы, которые соответствуют макет микрочипов.
7. Робот использует капиллярный канал контактов для печати Решения от образца пластину на 20 х 20 см нитроцеллюлозные мембраны, которая прикреплена к плоской пластине в машине. Каждое пятно на массив содержит 15 нл раствора и печатается в трех экземплярах.
8. Идентичные микрочипы будут напечатаны рядом друг с другом на мембране и разрезать на отдельные массивы после выполнения задания печати завершена.
9. В каждом эксперименте массивы могут быть модифицированы в целях удовлетворения более или менее образцов, разведения или репликации.

4. Зондирование Glycan Microarrays

1. После печати блокировать отдельные микрочипы в 5% вес / объем сухого обезжиренного молока растворяют в фосфатном буферном растворе (MPBS) при комнатной температуре в течение 2 ч для уменьшения неспецифического связывания.
2. Зонд микрочипов с помощью моноклональных антител, специфичных для клеточной стенки гликана эпитопов в течение 2 часов в MPBS. Большинство моноклональных Антибodies против гликанов клеточной стенки являются коммерчески доступными из трех компаний; Biosupplies ( www.biosupplies.com.au ), Carbosource Services ( www.carbosource.net ) и PlantProbes ( www.plantprobes.net ).
3. Включите отрицательного контроля, микрочип инкубируют только с MPBS и нет первичных антител.
4. Вымойте микрочипов в 3 раза фосфатным буферным раствором (PBS) в течение 5 мин для удаления неспецифического связывания.
5. Зонд микрочипы с вторичными антителами конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP) в MPBS в течение 2 часов. Большинство моноклональных антител против гликанов клеточной стенки требуют анти-мышь или крысу анти-вторичными антителами.
6. Повторите шаги стиральной 3 раза PBS буфера в течение 5 мин для удаления неспецифического связывания.
7. Разработка микрочипов использованием хромогенного (3,3-диаминобензидина) или chemiluminecent (люминол) подложках.

5. Квантификация

1. После разработки, сканировать отдельные микрочипы с использованием высокого разрешения (1200 точек на дюйм) настольный сканер и сохранять изображения как отрицательные, 16-разрядные файлы TIFF (рис. 3).
2. Вычислить интеграл интенсивности каждой месте с помощью Xplore Image Processing Software (LabNEXT), оснащенный автоматизированным инструментом сетки. Интегральной интенсивности пятна, полученные от суммы пикселов в сетке окрестностях каждого пятна.
3. Сетке данных для каждого микрочипов экспортируется в виде текстового файла и может быть вручную импортировать в электронную таблицу Excel для анализа. Онлайн-инструмент ( http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/ ) была разработана для автоматического перевода и обработки данных из отдельных файлов TXT.
4. Интегральной интенсивности пятна среднем по печати повторяет и разведения, чтобы получить "среднюю местеИнтенсивность 'значения для каждого образца (рис. 2). Кроме того, местная сигналы, соответствующие одной разведения значение в массиве используются для количественной оценки относительной эпитопа гликана изобилия для каждого образца.
5. Относительная средняя интенсивность место между различными образцами представлены в виде HeatMap (рис. 4) с помощью условного форматирования в Excel или в Интернете heatmapper инструментов ( http://bar.utoronto.ca/welcome.htm ). Данные для каждого типа антител корректируется до 100 и 5% пороговое значение накладывается для удаления фонового сигнала и ложных срабатываний.

Результаты

Относительное содержание гликанов в шести типов тканей (тычиночные нити, пыльца, яичников, лепестков, чашелистиков и стигма) из Nicotiana цветы Alata определяли с помощью CoMPP. 3А показывает представителя микрочипов, которые были исследовали с МАБ JIM5 специфичные для частичной (низкий) ...

Обсуждение

CoMPP это быстрый и чувствительный метод для профилирования гликана составе сотни растительного происхождения образцов в течение нескольких дней. Этот метод дополняет уже имеющиеся бактерий и млекопитающих гликана платформ массив для высокопроизводительного скрининга углеводов взаи...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
3 мм из карбида вольфрама бисера	Qiagen	69997
Коллекция микропробирок (1,2 мм)	Qiagen	19560	Пробирки на 1,5 мл микроцентрифуге также может быть использована
Qiagen TissueLyser II	Qiagen	85300
3 мм стеклянные бусины	Sigma Aldrich	Z143928
CDTA	Sigma Aldrich	34588
Кадмий оксид	Sigma Aldrich	202894
1,2-диаминоэтана	Sigma Aldrich	03550
Нитроцеллюлозные мембраны (0,22 мкм размер пор)	GE воды и технологических процессов	EP2HY00010	различных размеров пор мембраны подходят для различных типов контактных
Xact II microarrayer робот	Labnext	001A	Xact II робот был оснащен пользовательской 20 х 20 см керамическая пластина, к которой нитроцеллюлозные мембраны прилагается
Xtend RM контакты микрочипов	Labnext	0037-350	контакты должны быть пригодны для кровянистые выделения на мембранах
384-луночные планшеты для микротитрования (полипропилен)	Greiner	781207
Anti-гликанов моноклональных антител	Завод зонды / CarboSource / Biosupplies		Сайты, PlantProbes ( www.plantprobes.net ), Carbosource (ww.carbosource.net "целевых =" _blank "> www.carbosource.net) и Biosupplies ( www.biosupplies.com.au ).
Anti-IgG крысы (целая молекула) - пероксидазой антитела производятся в козла.	Сигма	A9037	Тип вторичные антитела зависит от первичных антител использовали (например, подняли крысы, мыши, козы и т.д.).
SIGMA БЫСТРО 3,3 '-диаминобензидина таблетки	Сигма	D4293	Тип развивающихся реагента зависит от вторичных антител используется и метод обнаружения (colourmetric, или chemiluminecent).
SuperSignal Запад Pico хемилюминесцентный субстрат	Thermoscientific	34080	см. выше
Xplore программное обеспечение для обработки изображений	LabNext	008	многие виды программного обеспечения с автоматической гриддинга инструменты доступныДля измерения Значение пикселя микрочипов пятна.
Растительных полисахаридов	Sigma / Megazyme