Изучение артериальной гладких мышц KV7 калиевых каналов функцию с помощью Patch Clamp электрофизиологии и давления Миография

Резюме

Измерения KV7 (KCNQ) калиевого канала активности в изолированной артериальной миоцитов (с помощью патча зажим электрофизиологические методы) параллельно с измерениями констриктор / расширитель ответы (с помощью давления миография) могут выявить важную информацию о роли KV7 каналы в гладких сосудистых мышц и физиологии фармакологии.

Аннотация

Сокращение или расслабление гладких мышечных клеток в стенах сопротивление артерий определяет диаметр артерий и тем самым контролирует поток крови через сосуд и вносит свой вклад в системное артериальное давление. Сокращение процесс регулируется прежде всего цитозольной концентрации кальция ([Ca ^{2 +]} _цит), которая в свою очередь контролируется с помощью различных ионных транспортеров и каналов. Ионные каналы являются общими промежуточных сигнальных путей активируется вазоактивных гормонов для осуществления сужение сосудов или сосудов. И ионные каналы зачастую становятся мишенью терапевтических агентов, либо намеренно (например, блокаторы кальциевых каналов используется, чтобы вызвать расширение сосудов и снижение артериального давления) или непреднамеренно (например, чтобы вызвать нежелательные сердечно-сосудистых побочных эффектов).

KV7 (KCNQ) напряжение активированного калиевых каналов в последнее время были вовлечены в качестве важной физиологической и терапевтической ТаргETS для регуляции сокращения гладких мышц. Для выяснения конкретных ролей KV7 каналов, как в физиологическом передачи сигнала и в действиях терапевтических агентов, мы должны изучить, как их деятельность модулированные на клеточном уровне, а также оценить их вклад в контексте интактной артерии.

Артерий крыс брыжеечных обеспечить полезную модель системы. Артерий может быть легко рассеченные, очищают от соединительной ткани и используются для подготовки изолированной артериальной миоциты для патч зажим электрофизиологии, или канюлю и давлением для измерения сосудосуживающие / сосудорасширяющее ответов при относительно физиологических условиях. Здесь мы опишем методы, используемые для обоих типов измерений и привести несколько примеров того, как экспериментальная конструкция может быть интегрирована, чтобы обеспечить более четкое понимание роли этих ионных каналов в регуляции сосудистого тонуса.

протокол

1. Хирургическое иссечение тонкого кишечника Аркады сосудистой Брыжеечные

1. Anesthetize 300-400 г Sprague-Dawley крыс с изофлурана (4%) вводят путем ингаляции.
2. Выполните средней линии лапаротомия, чтобы разоблачить брыжейки тонкого кишечника. Экстериоризироваться тонкой и толстой кишки через разрез брюшной стенки с большой осторожностью, чтобы избежать травм подвергаются кишечника и брыжейки. Осторожно раздуть брыжейки над стерильной марлей.
3. Хирургически вырезать тонкую кишку и часть толстой кишки, в том числе слепой кишки (кровеносные сосуды аккуратно разрезать вдоль поля и на происхождение от основной ветви верхней брыжеечной артерии / вены).
4. Передача вырезали ткань в стакан, содержащий ледяной рассекает решения (табл. 1).
5. После удаления кишечника, крыса должна быть гуманно усыпляют в то время как под наркозом.

2. DissectionD очистки артерий

1. Передача вырезали кишки и брыжеечных аркада для охлаждения рассекает камеры (4-5 ° C), содержащие рассекает решение. Камера состоит из 100-мм стекло чашки Петри с Sylgard 184 эластомера базы для размещения рассекает контактов; чашки Петри помещают в охлажденный база, которая поддерживается на уровне 4-5 ° С оборотной водой ванну.
2. Использование хирургических ножниц разрезать примерно 10-12 см сегмента из всего кишечника. Вырезать в каждом конце кишечного сегмента сохраняя свою сосудистой прилагается, а затем удалить неиспользуемые кишечник от камеры оставляя один сегмент с приложением ее сосудистую (брыжеечных аркада) в изоляции.
3. Придавить сегмента тонкой кишки, распространение брыжейки на ближайшую сторону камеры таким образом, что основной ветвью верхней брыжеечной артерии / вены в центре и последующего порядков излучать ответвления от центра (рис. 1). Pl Туз выводы только на кишечные сегменты (не на кровеносные сосуды).
4. Различают артерии от вен их относительно ярко-красного цвета, толстые стены и характерный V-формы ветви, а не на П-образной ветви видели в венах.
5. Визуализация через освещенный рассекает микроскопом, тщательно очистить жировой ткани и соединительной ткани, окружающие ^2-го - ^4-го порядка артерии близко к кишечника (пунктирная окружность на рисунке 1) с использованием микро щипцы и ножницы. Холдинг соседние вены облегчает очистку жировой ткани и соединительной ткани. Избегайте ненужных растяжении артерий.
6. Брыжеечные сегментах артерии очищена от соединительной ткани может быть вырезали и используется для выделения клеток (для одно-клеточных исследований патч зажим, разделы 3-4) или канюлю для давления миография (раздел 5). Вырезать сегменты между точками ветвления, как правило, до 1 см в длину.

jove_title "> 3. изоляторе исследований Patch Clamp

1. Подготовьте 0,5 л Изоляция решение (табл. 1) и разделите его на 2 части перед регулирования рН. Первая часть (обычно 100 мл) должна быть нагрета до 37 ° С и рН должен быть скорректирован до 7,2 при 37 ° C (37 ° C изоляция Solution). Вторая часть изоляции Решение должно быть охлажден до 4 ° С и рН должен быть скорректирован до 7,2 при 4 ° С (Ice холодный раствор изоляция). После рН, осмолярность оба решения должны быть скорректированы до 298 мосм путем добавления соответствующего количества D-глюкозы или H ₂ O.
2. Передача 2 мл 37 ° C изоляция Решение стеклянный пузырек и инкубировать при 37 ° C для использования в шаге 3.4. Добавить в дозе 20 мг бычьего сывороточного альбумина (БСА) до 10 мл 37 ° C изоляция решение, раствориться, разогреть до 37 ° C и корректировки рН до 7,2. К 2 мл этого раствора добавляют 4 мг коллагеназы типа VIII (Sigma, лот 089K8612: 633 Uнит / мг активность коллагеназы, 285 единиц / мг Caseinase деятельности, 1,6 единиц / мг Клострипан деятельности), 0,64 мг эластазы типа IV (Sigma, лот 110M7025V 5,9 единиц / мг, добавить 40 мкл 16 мг / мл акции подготовлены в 37 ° C изоляция Solution) и 2 мкл 1 М DL-дитиотреитол (DTT Sigma); предварительно теплой этого ферментного раствора до 37 ° С в рамках подготовки к шагу 3.5.
3. Передача 2-3 сегментах брыжеечной артерии в 35-мм ткань культуры блюдо, содержащий 2 мл ледяного Решение изоляции и места блюдо на льду. Вырезать брыжеечной артерии в сегментах 3-4 мм длиной штук.
4. С помощью пипетки Пастера с огнем полированный наконечник (для предотвращения повреждения артерий) передавать артериальных сегментов в стеклянный флакон (15 х 45 мм, 1 драм), содержащий 2 мл подогретого 37 ° C Решение изоляции и инкубировать в течение 30 мин при 37 ° C.
5. Через 30 минут тщательно аспирации 37 ° C изоляция Решение с помощью пипетки Пастера, добавить 2 мл теплого раствора фермента и инкубировать в течение 35 минпри 37 ° C.
6. Сразу же после 35 мин инкубации в растворе фермента, поместить флакон на льду, аспирации раствора фермента и добавить 2 мл ледяного Решение изоляции (стремление повторить и добавлением свежей ледяной Решение изоляция 4 раза). Тогда, в объеме 1 мл ледяной Решение изоляции, осторожно растирают артериальных сегментов с полированной пипетки Пастера в 10-20 раз, чтобы освободить отдельных брыжеечной артерии гладкие мышечные клетки (MASMCs).
7. Периодически проверять миоцитов внешний вид, поместив каплю суспензии клеток на 35-мм чашку и просмотре под микроскопом. Здоровый MASMCs должны иметь гладкую удлиненный внешний вид. Не все клетки в артериальной стенке будут освобождены. Клеточную суспензию следует хранить на льду.
8. Другим важным показателем здоровья MASMC является их толерантность физиологических Ca ^{2 +} концентрации. Заполните записи камеры (Bioscience инструменты, # CSC-25L) с ванной сЕШЕНИЕ, содержащей 2 мМ CaCl ₂ (рН 7,3 при комнатной температуре (RT), для состава см. Таблицу 1) и положение агар моста (изогнутый стеклянный капилляр заполнен на 2% агара в 2 M KCl, вставляется в электрод (Warner инструмента, REF -3L)) внутри камеры. Использование полированного пипетки Пастера перенести приблизительно 100-200 мкл суспензии клеток в записи камеры и позволяют клеткам придерживаться в течение 15 мин. Неповрежденные клетки не должны сокращаться значительно в 2 мМ CaCl _{2-раствор,} содержащий (клетки должны по всей видимости, удлиненные или палочковидные, не округляются вверх в шары).
9. После добавления первой аликвоты суспензии клеток с записью камеры, 0,25 мл ванну раствор, содержащий 2 мМ CaCl ₂ следует добавить оставшийся объем клеточной суспензии. Это оставшуюся суспензию клеток могут быть сохранены в этом решении на льду и использовать для исправления зажим для записи до 6 часов.

4.Использование всего клещи Patch сотовых измерить KV7 калиевых токов или мембранные напряжения

1. После миоцитов придерживаться стекла базу записи камеры (25-мм № 1 раунд покровного стекла, Warner Instruments), инициировать непрерывную перфузию ванной решения (табл. 1). Для записи KV7 токов в отрыве от задержки калия выпрямитель тока Kv1 и KV2 семей, ванны решение должно быть дополнено 100 мкМ GdCl _3.
2. Изготовление патч пипетки из боросиликатного стекла (Kimax-51, Кимбл Chase) с помощью пипетки съемника и microforge, его сопротивление должно быть 4-5 МОм при наполнении внутреннего решения (табл. 1). Пальто ниже ^_1/3 от пипетки (~ 1-2 мм выше чаевые) с Sylgard 184.
3. Для записи KV7 токов в MASMCs, перфорированные патч целом напряжение ячейки метода фиксации должны быть использованы. Использование перфорированных конфигурации патч помогает предотвратить depletioп мембраны фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфат (PIP ₂₎ и последующего быстрого (в течение 5 мин) краткое изложение KV7 токи, которые обычно наблюдаются с использованием обычного разрыва конфигурации патч. Дополнение внутреннее решение (табл. 1) с 120 мкг / мл амфотерицина: добавляют 3 мкл 2 мг / мл запас Амфотерицин (подготовлен в ДМСО и хранить в замороженном состоянии в небольшие аликвоты и защищенном от света) до 0,5 мл внутреннее решение. Заполните кончик патч пипетки с Амфотерицин без внутреннего решения путем погружения пипетки в Амфотерицин без внутреннего решения, а затем применять всасывающие на другом конце с помощью 10 мл шприца, подключенные через кусок трубы (Tygon R- 3603). Добавить Амфотерицин содержащего раствор пипеткой с верхнего использованием Eppendorf Microloader пипетки до пипетки составляет примерно половину заполнен раствором. Удалите пузырьки воздуха, слегка нажав пипетки. С помощью пипетки сразу.
4. Вставьте в пипеткув держатель электрода и использовать микроманипулятора снизить пипетки на поверхность удлиненной миоцитов (близко к, но не в верхней части ядра, рисунок 2). Когда сопротивление в пипетку увеличивается до 6-10 МОм, применять всасывающие для достижения гига-уплотнение (> 10 ГОм).
5. Установить проведения напряжение 0 мВ при ожидании мембраны перфорации. Примените 100 мс напряжение шага до +10 мВ, а затем до -10 мВ, и использовать усилитель для компенсации быстрых переходных емкость пипетки. Одновременно с появлением целой клетки емкости переходных процессов, небольшие устойчивые положительные токи (обычно 2-10 рА) будет свидетельствовать о наличии функциональной KV7 каналов.
6. Успешное перфорация с Амфотерицин снизит доступ сопротивление до 35 МОм или меньше. Данной записи может быть начато по 5 сек Напряжение шага протокол от -4 напряжения холдинга мВ. Мы используем -4 мВ проведение напряжения для достижения максимальной рядом инактивации других видов задержки RECtifier калиевых токов (опосредовано преимущественно Kv1 и KV2 каналов), которые могли бы загрязнять записи относительно небольшие, не инактивируют KV7 токов. В долгосрочной (5 сек) Напряжение шага протокола необходимо для достижения стационарного активации KV7 каналы, которые демонстрируют медленное напряжение-зависимой активации и дезактивации. KV7 токи не инактивируют в течение устойчивые шаги напряжение.
7. Для записи KV7 тока напряжением (IV) отношения, применяют 5 сек напряжение шаги для напряжений в диапазоне от -84 мВ, при котором открыты вероятность KV7 каналов минимально, до +16 мВ, при котором открыты вероятность KV7 каналов достигает плато, через 5 сек на каждом испытательном напряжении, чтобы вернуться к проведению напряжения (-4 мВ) на 10 сек. Это займет около 3,5 мин для полной серии испытательных импульсов (рис. 3А). Выполните 2-3 IV управления записями для того, чтобы записанные токи стабильными во времени. Участок среднем конца импульсных токов (в среднемтоков записаны за последние 1 сек) по сравнению с напряжением создать IV кривой (рис. 3D). Контроль ВАХ должна быть примерно накладываются если токи являются стабильными.
8. Перед применением любых фармакологических препаратов инициировать Протокол время курс предназначен для непрерывной записи ток при -20 мВ. Обеспечить стабильную запись текущей по крайней мере, 5 мин до применения препарата. Применение фармакологических препаратов в течение 5-15 минут или до стационарного достигается (рис. 3), а затем прекратить протокол времени курс и записывать две IV кривых с помощью напряжения шага протокола. Вымывание наркотиков и записывать время курс лекарственной вымывания, после записи двух дополнительных кривых IV.
9. В конце эксперимента применяется linopirdine 10 мкм и 10 мкм XE991, необратимые ингибиторы KV7 каналов; эти препараты должны полностью подавлять токи записан при напряжении отрицательных до -20 мВ (рис. 3D).
10. После каждого эксперимента мыть камеру и перфузионной системы с моющим средством, этаноле и горячей воде, чтобы удалить любые следы препаратов, используемых.

5. Использование неповрежденном сегменты артерии для давления Миография

1. Давление в системе миографа приобрести датские Мио Technology (DMT A / S, Дания, модель 110P) используется для эксперимента миография давления. Установите артерии сегмента в камеру из нержавеющей стали, вставляя горизонтально зафиксировано левой канюли стекло в один конец и подвижной правой канюли стекло в другом конце. Два датчиков давления (P1 справа и P2 на левой стороне) встроены в мониторинг давления в артерии просвет. Жидкость с правой канюли стекло будет использоваться для регулировки давления внутри артерии своим приближенным физиологическом уровне. Для начала, предварительно заполнить открытые 10 мл шприц (выступающей в качестве давления колонки подачи тяжести), с просветом решения (табл. 1). Поднимите шприц, чтобы подтолкнуть решениения с помощью полиэтиленовых труб в правом канюли стекло, стараясь избежать пузырьков воздуха в трубку или канюлю. Левая канюли должны быть предварительно заполнены просвет решение по 1 мл шприца. Заполните давления в камере миографа с 10 мл раствора судна ванну (табл. 1). Свободно приостановить два готовых тонких нейлоновых нитей с каждой стороны примыкает к стеклянной канюлей.
2. Тщательно передачи расчлененный сегменте брыжеечной артерии (обычно ^3-го или ^4-го порядка сегмент, около 200 - 350 мкм в диаметре, с шагом 2,6) от рассечения камеры в камеру миографа давление держится на одном конце отрезка с помощью микро щипцы.
3. Визуализация через освещенный рассекает микроскопом, удерживая один конец артерии сегмента и осторожно сдвиньте ее над левой канюли стекла и закрепления конца помощью нейлоновой нити. Аккуратно промойте полость жидкости через установленный сосуд для удаления крови и грязи внутри сосуда.Клапан в левом шприце должна быть закрыта, так что эта сторона представляет собой статическую столба жидкости, против которых давление регулируется с правой стороны.
4. Использование микроманипулятора, положение подвижной правой канюли стекла ближе к артерии сегмента и потяните правый конец отрезка над ним, наконец, закрепив его с нейлоновой нити. Клип излишки темы шва.
5. Установите устройство давления миографа на сцене над микроскопом миографа давления. Установите крышку над камерой миографа давления. Крышка для камеры содержит входной superfusion и всасывающей трубы прилагается к нему. Подключите superfusion входе в коллектор, чтобы superfusion номера Температура ванны или 60 мм раствора хлорида калия в камере давления миографа под действием силы тяжести. Тест вещества, такие как наркотики или гормоны, которые находятся в измерениях патч зажим повлиять на KV7 функцию канала, как правило, наносится непосредственно на ванну решения, а не через ванну вирerfusion или в растворе просвет. Superfusion ванны решения будут использованы, чтобы смыть раствор KCl. Прикрепить всасывающей трубы с вакуумной системой для удаления избытка superfusate. Вставьте датчик температуры в ванну раствор через отверстие в крышке камеры миографа.
6. Подключите устройство давления миографа в мио-интерфейс системы, аппаратные средства, которые позволяют связи миографа блока к программному обеспечению myoview (DMT).
7. Откройте myoview программного обеспечения на компьютер. В окне параметров, установить целевую температуру до 35 ° C при температуре допуск 1 ° C, целевые поступления давление 80 мм рт.ст. и целевой отток давления до 80 мм рт. Загрузите файл калибровки и калибровки судна наружный диаметр, так что изменения в артерии диаметром записываются точно в микронах. Настройте контрастность при необходимости включить хороший вид смонтированной сегменте на фоне. Подробное описание того, как использовать программное обеспечениепредусмотрено в руководстве по DMT.
8. Постепенно повышайте 10 мл шприц (выступающей в качестве давления колонки подачи тяжести) в течение 15 мин, пока датчик давления P1 читает 80 мм рт. В то время как повышение давления, колонки, проверьте, нет ли течи в судне. Если есть утечка, отказаться от сегмента и подключите другой артерии сегмента (повторите шаги от 5,2). Отрегулируйте расстояние между канюлей, когда это необходимо. Расстояние должно быть отрегулировано таким образом, что под давлением сегмента артерии составляет около прямой (но не растягивается) и образует плечо, как-шаблон, в котором связей сделаны (рис. 4а).
9. Включите отопление в камере миографа давления через контроль в мио-интерфейс системы. Разрешить ванну решение, чтобы нагреть постепенно, пока не достигнет 36-37 ° C.
10. Используйте XYZ корректировка целей в DMT микроскопа, когда это необходимо для поддержания судна в центре внимания и облегчения точного отслеживания чAnges с внешним диаметром сосуда.
11. Проверка жизнеспособности судна установлен переходный superfusion (~ 30 сек) с 60 мМ KCl. Жизнеспособной судна сужает быстро на добавление KCl и расширяет сразу же после вымывания из 60 мМ KCl (переливать примерно 60 мл ванны решение, чтобы смыть KCl). После этого испытания, скорректировать объем ванны решение ровно 10 мл. Температура воды в ванне снижается во время теста KCl и вымывания, потому что эти решения при комнатной температуре, но в камере нагревателя будет восстанавливать температуру до 36-37 ° C в течение нескольких минут.
12. Разрешить артерии, чтобы уравновесить по крайней мере, 30 минут (диаметр должен быть стабильным в течение по крайней мере последних 10 минут этот период). Добавить концентрированного исследуемого вещества в ванну раствор непосредственно и пипетировать взад и вперед осторожно вблизи краев камеры для смешивания исследуемого вещества в ванне решение, уступая соответствующие конечной концентрации в 10 мл объема камеры. ChanГЭС в следующем диаметр сосуда того испытуемого вещества (ы) можно наблюдать в видеоизображение, а также наметил в окно анализа изображений в то время как эксперимент продолжается.
13. После завершения эксперимента, хранящихся данных (*. Мио-файл) можно открыть файл электронной таблицы для последующего анализа.

6. Представитель результаты

Результат показан на рисунке 3 иллюстрирует типичные записи KV7 токи от брыжеечной артерии миоцитов при напряжении протокол шаг, прежде чем (рис. 3А, Б черные следы) и во время лечения KV7 канал активатора Zn пиритион (ZnPyr, 100 нм; 3А, Б красные следы). Похожие напряжения шага данным от 3 ​​клетки были усреднены для подготовки тока напряжением (IV) участки показаны в 3D рис. Конечно время представитель повышение амплитуды тока (измеряется постоянное напряжение зажима при -20 мВ) Даринаг лечение с 100 нМ Zn пиритион показан на рисунке 3C рисунок 4B иллюстрирует ход времени влияния ZnPyr на брыжеечной артерии наружный диаметр измеряется с помощью давления миография;. судно было предварительно суженной с 100 пМ аргинин-вазопрессин (AVP) до Помимо 100 нМ ZnPyr. Усредненная доза-реакция данные для ZnPyr вызванных брыжеечных расширение артерии показано на рисунке 4С.

Рисунок 1. Изображение брыжеечных аркада в анатомическом театре камеры.

Рисунок 2. Изображение миоцитов с патчем пипеткой на его поверхности.

Рисунок 3. Оригинальные следы KV7 токов, время курс препаратов Приложение, IV кривые. А. Семья последовательных текущих следов (нижняя панель), записанный в ответ на напряжение шага (верхняя панель) до лечения (контроль, черные) и последующей стабилизацией в присутствии 100 нМ ZnPyr (красный) в одном MASMC. B. Представитель текущего следы (как показано стрелками) для управления (черный) и 100 нМ ZnPyr (красный). Серые бары указывают на временной интервал, когда усредненная амплитуды тока были измерены вольт-амперных (IV) участков. Шаг напряжения указано справа на наконечники для стрел. C. Время ходе KV7 текущего повышение на 100 нМ ZnPyr измеряется с непрерывным зажим напряжения при -20 мВ (бар). D. Средний IV кривых (п = 3), полученные из KV7 плотностях тока, записанные до (контроль, черные кружки), при лечении 100 нМ ZnPyr (кружки), и во время лечения с 10 мкМ XE991 (заполненные треугольники). Неспецифические токи утечки были вычтены как описано Passmore и соавт. ^1.

ных ">
Рисунок 4. ZnPyr индуцированной релаксации брыжеечной артерии предварительно суженной с 100 AVP пМ. А. Фотография брыжеечной артерии установлен в давлении миографа настройки. B. Время хода изменений в наружный диаметр сосуда в ответ на применение 100 пМ AVP (открытый бар) с последующим применением 100 нМ ZnPyr (заполненный бар). C. Гистограмма подводя итоги 100 нМ ZnPyr вызванных vasodilaion.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Методы и экспериментальных подходов, описанных здесь довольно надежная и может производить четкие и воспроизводимые результаты при применении с тщательным вниманием к деталям. Хорошо электрофизиологических записей и сужение / расширение артериальных сегментов зависит от здоровья к...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Имя	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
Хлористый натрий	Сигма	S5886	Пройдя Решение: 145 Ванна решение для электрофизиологии *: 140 Внутреннее решение для электрофизиологии: 10 Изоляция решение для миоциты *: 140 Ванна решение для давления миография: 145 Lumen решение для давления миография: 145
Хлористый калий	Сигма	P5405	Пройдя Решение: 4.7 Ванна решение для электрофизиологии *: 5,36 Внутреннее решение для электрофизиологии: 135 Изоляция решение для миоциты *: 5,36 Ванна решение для давления миография: 4,7 Lumen решение для давления миография: 4,7
Калий EGTA	Сигма	E4378	Внутреннее решение для электрофизиологии: 0,05
HEPES	Сигма	H9136	Ванна решение для электрофизиологии *: 10 Внутреннее решение для электрофизиологии: 10 Изоляция решение для миоциты *: 10
Динатрийгидрофосфат	Сигма	S5136	Изоляция решение для миоциты *: 0,34
Калий гидрофосфат	Сигма	P5655	Изоляция решение для миоциты *: 0,44
Хлорид магния	Сигма	M2393	Ванна решение для электрофизиологии *: 1,2 Внутреннее решение для электрофизиологии: 1 Изоляция решение для миоциты *: 1,2
Хлорид кальция	Сигма	C7902	Ванна решение для электрофизиологии *: 2 Изоляция решение для миоциты *: 0,05
Фосфат натрия	Fisher Scientific	BP331-1	Пройдя Решение: 1,2 Ванна решение для давления миография: 1,2 Lumen решение для давления миография: 1,2
Сульфат магния	Сигма	M2643	Пройдя Решение: 1,17 Ванна решение для давления миография: 1,17 Lumen решение для давления миография: 1,17
MOPS	Fisher Scientific	BP308	Пройдя Решение: 3 Ванна решение для давления миография: 3 Lumen решение для давления миография: 3
Пировиноградная кислота	Сигма	P4562	Пройдя Решение: 2 Ванна решение дляДавление миография: 2 Lumen решение для давления миография: 2
EDTA дигидрат	Исследования Organics	9572E	Пройдя Решение: 0,02 Ванна решение для давления миография: 0,02 Lumen решение для давления миография: 0,02
D-глюкозы	Сигма	G7021	Пройдя Решение: 5 Ванна решение для электрофизиологии *: 10 Внутреннее решение для электрофизиологии: 20 Изоляция решение для миоциты *: 10 Ванна решение для давления миография: 5 Lumen решение для давления миография: 5
Бычий сывороточный альбумин	Сигма	A3912	Пройдя Решение: 1% Lumen решение для давления миография: 1%
рН			Пройдя Solutioп: 7,4 Ванна решение для электрофизиологии *: 7,3 Внутреннее решение для электрофизиологии: 7,2 Изоляция решение для миоциты *: 7,2 Ванна решение для давления миография: 7,4 Lumen решение для давления миография: 7,4
Осмолярность			Пройдя Решение: 300 Ванна решение для электрофизиологии *: 298 Внутреннее решение для электрофизиологии: 298 Изоляция решение для миоциты *: 298 Ванна решение для давления миография: 300 Lumen решение для давления миография: 300
			* 11
			Таблица 1. Компоненты решения, используемые в эксперименте.