Инженерные скелетных мышечных тканей из мышиных миобластов клеток-предшественников и применения электрической стимуляции

Резюме

Engineered мышечной ткани имеет большой потенциал в регенеративной медицине, как болезнь модели, а также в качестве альтернативного источника для мяса. Здесь мы описываем техники мышц конструкции, в данном случае от мыши миобластов клеток-предшественников, а также стимуляции электрическими импульсами.

Аннотация

Разработан мышечных тканей может быть использован для различных целей, в том числе производство тканей для использования в качестве модели заболевания в пробирке, например, для изучения пролежней, для восстановительной медицины и в качестве мяса альтернативные ^1. В первом сообщалось 3D конструкций мышцы были сделаны много лет назад и пионерами в этой области являются Vandenburgh и коллег ^2,3. Авансы в мышцах тканевой инженерии являются не только результатом огромного выигрыша в знаниях биохимических факторов, стволовых клеток и клеток-предшественников, но и, в частности, основанные на выводы, полученные исследователями, что физические факторы играют существенную роль в контроле клеточного поведения и развитие тканей. Государство-оф-искусство инженерных мышцы строит в настоящее время состоит из ячейки населенных конструкций гидрогеля. В нашей лаборатории это обычно состоят из мышиных миобластов клеток-предшественников, выделенных из мышиных задних мышц конечностей или мышиной линии клеток миобластов C2C12, мильфиксировано смесью коллаген / Matrigel и помещают между двумя точками крепления, имитируя мышцы связки. Другие клетки могут быть рассмотрены, а также, например, альтернативных клеточных линий, таких как L6 миобластов крысы ^4, новорожденных мышц, полученных клеток-предшественников, ^5, клеток, полученных из взрослых тканей мышц от других видов, таких как человека ⁶ или даже индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (индуцированных плюрипотентных клеток) ⁷ . Сотовые сократимость вызывает выравнивание ячеек вдоль длинной оси конструкции ^8,9 и дифференциацию клеток-предшественников мышц приблизительно через одну неделю культуре. Кроме того, применение электрической стимуляции может улучшить процесс дифференциации в некоторой степени ^8. Из-за своего ограниченного размера (8 х 2 х 0,5 мм), полная ткани могут быть проанализированы с помощью конфокальной микроскопии для контроля, например, жизнеспособность, дифференциация и выравнивание ячейки. В зависимости от конкретного применения требований к инженернокрасные мышечные ткани будет меняться, например, использование для регенеративной медицины требуется масштабирование до размеров ткани и васкуляризации, а в качестве перевода мясо альтернативой другим видам необходимости.

протокол

1. Культуры миобластов мышиной клетки-предшественники или клетки C2C12

1. Изолировать клеток в соответствии с протоколом первоначально опубликовано Шефер и его коллеги ¹⁰ и более поздних адаптированы Collins и соавт. Боонен ¹¹ и соавт. ¹² и хранить их в жидком азоте. Это требует мышей, например, C57Bl / 6. Альтернативные методы, которые используются в других лабораториях, например, метода опубликована в журнале Визуализированные Эксперименты Li Y и соавт. ^13. Для реактивов и оборудования вам следует обратиться к таблице на стр. 7 и 8. Из мышц от одной мыши вы, как правило получить достаточное количество клеток для криоконсервирования около 20 флаконов в жидком азоте. Далее, мы начинаем протокол таять клетки от жидком азоте.
2. Поместите клетки от 1 флакона в 25 см ² Matrigel (1 мг / мл) с покрытием колбы культуры тканей и добавить питательную среду (GM), состоящей из (335 мл DMEM передовой, 100 мл плода Бовинэлектронной сыворотки (FBS), 50 мл HS, 5 мл пенициллина / стрептомицина, 5 мл L-глутамина, 5 мл куриного эмбриона экстракт (ЦВЕ)).

Примечание: пальто в течение 2 ч при комнатной температуре и удалить Matrigel стремлением.

3. Субкультура клеток примерно 1:03 каждые 3 дня.
   Это означает: на 3-й день: Переход от одной клетки 25 см ² до 75 см ² колбы, на 6-й день: переход от одной клетки 75 см ² колбы с двумя 150 см ² колбы (с 30 мин preplating в колбах без покрытия). На 9-й день передачи на расстоянии 150 см ² колбы до 1 трехместный 150 см ² колбы, или если недоступны до трех 150 см ² колбы (при необходимости preplate опять же в зависимости от фенотипа клеток). На 12-й день клетки готовы для посева в мышцу конструкции.

Примечания: - За тройное 150 см ² числа клеток составит примерно 4,5 х 10 ⁶ клеток.
- Используйте помощьюLs из различных выделений смешивать их для получения смешанной популяции клеток во время посева.

Примечание: Если вы не хотите работать с первичными клетками, C2C12 миобластов являются хорошей альтернативой.

2. Инженерные скелетных мышечных тканей

1. Подготовка кремния клея путем смешивания "эластомер" с "отвердителя" (10:1). Вырезать + / - 5 мм квадратных сегментов липучкой с одной стороны треугольного (дом-образную форму; рис. 1). Клей липучки в лунки 6-луночный культуральный планшет в пространстве примерно на 12 мм между квадратами.

Примечания: - используйте только мягкую сторону липучки и сталкиваются с этой стороной вверх.
- Убедитесь, что крышам навстречу друг другу.
- Только покрытие Velcro с силиконовым клеем, не распространяются клея во всем хорошо.
- Для дальнейшего электрической стимуляции уместно привести конструкций в вертикальном направлении и плели (вдоль длинной оси).

2. Оставьте сохнуть в течение ночи в вакуумной печи, не отапливается, в первую очередь, чтобы удалить пузырьки воздуха. Стерилизовать добавлением 70% этанола в лунки и инкубировать в течение 15 мин. Промыть 3 раза с PBS и поставить под УФ в течение 15 мин. Удалите все PBS из скважин и липучки и место в инкубаторе до использования.
3. Оттепель Matrigel решение в холодильнике и подготовки раствора коллагена до нужной концентрации незадолго до принятия 3D конструкций. Развести фондовом коллагена стерильным 0,02% уксусной кислоты (конечная концентрация 3,2 мг / мл).

Примечание: оставить все на льду.

4. Trypsinize клетки, ресуспендирования в GM и кол. Оставьте клеток в центрифуге трубки в инкубаторе.
5. Добавить необходимое количество коллагена раствора для чисел конструкций, которые вы хотите, чтобы к трубке (в соответствии с таблицей 1), добавляют 0,5 М NaOH до этого раствора коллагена до светло-розового колоГ указывает, рН 7,5. Осторожно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз и избежать образования пузырьков. Затем добавить Matrigel и смешать очень осторожно, но тщательно. Наконец, добавьте ГМ коллаген / Matrigel смеси (при соответствующем количестве см. Таблицу 1).

Примечания: - Выполняйте каждый шаг на льду! Matrigel и коллагена охотно гель при повышении температуры.
- Имейте в виду, что цвет действительно розовый! Увеличение рН также вызывает быстрое застывание.
- Конечная концентрация коллагена: 1,6 мг / мл.

6. Центрифуга нужное количество клеток при 1000 оборотов в минуту в течение 5 минут и удалить супернатант.

Примечание: - В зависимости от активности клеток число клеток в построить нуждается в корректировке. Как правило, количество клеток находится между 750000 и 1250000 клеток на конструкцию.

7. Использование некоторых из геля смесь ресуспендируют осадок клетоки передать клеток в оставшуюся смесь и тщательно перемешать, но без введения пузырьков воздуха.
8. Возьмите разогретую также пластин из инкубатора и пипеткой 0,35 -0,4 мл клетки-гель смесь в липучки в первую очередь. Затем начинают пипетировать смесь из центра между вложений сайтах и ​​распространяются на липучке. Наконец, используйте оставшуюся часть геля, чтобы заполнить разрыв между двумя якорями липучки и пипеткой по части липучки.
9. Тщательно проверьте через 5-10 мин, если гели достаточно прочной, чтобы быть переданы, то есть слегка постучите по блюд и визуального осмотра, если гель будет жесткой. Если это так, осторожно поместите посуду в инкубаторе. Как правило, они могут быть подняты через десять минут. Затем, после 1-2 часов, аккуратно накладываются друг на гель с 4 мл теплой GM.

Примечание:-Не делайте никаких энергичных движений при обработке пластин.

10. Заменить GM дифференциация среды (рост среднегобез куриных эмбрионов экстракт), после 24 часов, и заменить свежей среде каждые 2-3 дня. На 7-й день вы должны были получить зрелые ориентированных волокон мышц, а может быть оценена с окрашиванием для кросс-разработки страт в расплавленном мышечных волокон.

3. Электрическая стимуляция

1. Стерилизовать электроды от пластины ionoptix (см. таблицу реагентов и оборудования) перед использованием с 70% этанола и затем сушат под УФ в безопасности кабинета. Поместите пластину с электродами на культуру пластину с конструкциями и накрыть крышкой от пластины культуры и передачу инкубатора. Подключите Ionoptix C-иноходца с соответствующими кабелями.

Примечание: электроды расположены параллельно рядом с мышц конструкции (рис. 2).

2. Применение протокола стимуляции, как ожидалось.

Примечание: Мы обычно используем 4 В / см,6 мс импульсы с частотой 2 Гц. Изменение культуры средних каждые 24 часа во время стимуляции.

Результаты

Конечный продукт будет мышцы конструкции, как показано на рисунке 3. Размер ткани будет около 8 мм длиной, 2 мм шириной и толщиной 0,5 мм. Электрическая стимуляция при дифференциации будет менять выражение изоформ миозина тяжелой цепи, но не значительно повысить дифференциацию п?...

Обсуждение

Инженерные мышечной ткани имеет большой потенциал для использования в качестве модели заболевания, для скрининга лекарственных средств, в регенеративной медицине и для производства мяса. Тем не менее, требования к этим приложениям меняться. Мы решили работать с комбинацией коллагена...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
Matrigel фактор роста уменьшена	Beckton и Дикинсон
DMEM (высокий уровень глюкозы) *	Gibco	42430
Расширенный DMEM	Gibco	12491
Лошадиная сыворотка	Gibco	65050-122
Эмбриональной бычьей сывороткой	Greiner	758075
0,45 и 0,22 мкм шприц фильтр *	Whatmann (Schleicher и Scheull)	10462100
L-глютамин	Gibco	25030024
Пенициллина / стрептомицина	Gibco	10378016
Амфотерицин	Gibco	15290-018
Культура пластиковые	Greiner		Включает в себя культуру колб и пипеток
Экстракт куриных эмбрионов	Соединенные Штаты Биологические	C3999
Пипетки Пастера *	Хильгенберг		Пипетки Пастера, с перетяжкой, с хлопком, открытые L совет: 230 мм с наконечником диаметром 0,9 - 1,1 мм
Пипетки Пастера *	Хильгенберг		Пипетки Пастера, с перетяжкой, с хлопком, открытые L совет: 230 мм с наконечником диаметром 1,4 - 1,6 мм
Пипетки Пастера	VWR	612-1702
Коллагеназы типа I*	Сигма	C0130-16
40 мкм ячейки фильтра *	BD Falcon	352340
19G иглу
Эластомер	Корпорация Dow Corning	3097358-1004	Silastic MDX 4-4210 #
Отвердитель	Корпорация Dow Corning		Silastic MDX 4-4210 #
Липучка	Регулярные магазине		Вы можете купить это в обычных магазинах, используйте только мягкую сторону
Коллаген типа I, крысы хвост	BD Biosciences	3544236
C-Pace EP культуры Pacer	Ionoptix
6-а культура блюда для электрической стимуляции	Becкт Dickinson-Falcon	BD Falcon # 353846
C-Dish электродов культуры блюдо	Ionoptix
			* Необходимые для выделения клеток (пункт 1.1) # Вместе в одном комплекте