Оценка митохондриальной функции и жизнеспособности клеток в клетках почек гиперэкспрессией протеинкиназы С Изоферменты

Резюме

Эффект активации протеинкиназы С (ПКС) изоферментов на митохондриальной функции, связанные с дыхания и окислительного фосфорилирования и на жизнеспособность клеток описаны. Подход адаптируется аденовирусной техники выборочно сверхэкспрессировать PKC изоферменты в первичной культуре клеток и различные анализы для определения функций митохондрий и энергетический статус клетки.

Аннотация

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC regulates mitochondrial function and cellular energy status. Numerous reports demonstrated that the activation of PKC-a and PKC-ε improves mitochondrial function in the ischemic heart and mediates cardioprotection. In contrast, we have demonstrated that PKC-α and PKC-ε are involved in nephrotoxicant-induced mitochondrial dysfunction and cell death in kidney cells. Therefore, the goal of this study was to develop an in vitro model of renal cells maintaining active mitochondrial functions in which PKC isozymes could be selectively activated or inhibited to determine their role in regulation of oxidative phosphorylation and cell survival. Primary cultures of renal proximal tubular cells (RPTC) were cultured in improved conditions resulting in mitochondrial respiration and activity of mitochondrial enzymes similar to those in RPTC in vivo. Because traditional transfection techniques (Lipofectamine, electroporation) are inefficient in primary cultures and have adverse effects on mitochondrial function, PKC-ε mutant cDNAs were delivered to RPTC through adenoviral vectors. This approach results in transfection of over 90% cultured RPTC.

Here, we present methods for assessing the role of PKC-ε in: 1. regulation of mitochondrial morphology and functions associated with ATP synthesis, and 2. survival of RPTC in primary culture. PKC-ε is activated by overexpressing the constitutively active PKC-ε mutant. PKC-ε is inhibited by overexpressing the inactive mutant of PKC-ε. Mitochondrial function is assessed by examining respiration, integrity of the respiratory chain, activities of respiratory complexes and F₀F₁-ATPase, ATP production rate, and ATP content. Respiration is assessed in digitonin-permeabilized RPTC as state 3 (maximum respiration in the presence of excess substrates and ADP) and uncoupled respirations. Integrity of the respiratory chain is assessed by measuring activities of all four complexes of the respiratory chain in isolated mitochondria. Capacity of oxidative phosphorylation is evaluated by measuring the mitochondrial membrane potential, ATP production rate, and activity of F₀F₁-ATPase. Energy status of RPTC is assessed by determining the intracellular ATP content. Mitochondrial morphology in live cells is visualized using MitoTracker Red 580, a fluorescent dye that specifically accumulates in mitochondria, and live monolayers are examined under a fluorescent microscope. RPTC viability is assessed using annexin V/propidium iodide staining followed by flow cytometry to determine apoptosis and oncosis.

These methods allow for a selective activation/inhibition of individual PKC isozymes to assess their role in cellular functions in a variety of physiological and pathological conditions that can be reproduced in in vitro.

протокол

1. Выделение почечных проксимальных канальцах для первичной культуры

1. Anesthetize кролика, акцизы обе почки и поместить их в чашку Петри заполнена стерильной буфера подготовки (DMEM/F12 среда) в ламинарном боксе.
2. Заливать каждую почку с 50 мл буфера Подготовка затем 50 мл стерильной фосфатно-солевой буфер, рН 7,4 (PBS), и PBS-оксид железа решение (45 мл + 5 мл). Де-капсулированной почек и передавать их на подготовительные буфер, содержащий дефероксамин.
3. Заготавливают кору каждую почку.
4. Однородный ткани, используя 15 мл Dounce гомогенизатора. Залить гомогената более 2 стерильных сита сетки (85 мкм на дне и 235 мкм сверху) размещены на 1 л стерильной стакан. Промойте сита с дефероксамин содержащего буфер.
5. Собирать любую ткань остается на сите 85 мкм в стерильные конические центрифужные пробирки заполнены 35-40 мл дефероксамин содержащего буфер. Аккуратно перемешайте суспензию клеток.
6. Поместите сильной мAgnet снаружи трубки для удаления железа заполнены клубочков и пусть подвески обосноваться. Аспирируйте железа от магнита помощью пипетки Пастера. Повторите этот процесс.
7. Подготовить 1 мл пищеварения среде, содержащей 2,400-2,500 единицы коллагеназы I и 0,6 мг соевого ингибитора трипсина растворяют в дефероксамин содержащего буфер. Фильтр-стерилизовать пищеварения среды.
8. Регулировка громкости клеточной суспензии в 40 мл и добавляют 1 мл пищеварения среды. Выдержите при комнатной температуре в течение 17 мин осторожно смешивания подвеска, центрифуги на 50 мкг в течение 2 мин при 4 ° C, аспирации среды, и добавить свежего буфера дефероксамин.
9. Повторите железа удаление процедуры с магнитом несколько раз, спина подвески вниз, аспирации среды, и добавить 46 мл среды, содержащей не глюкозу.
10. Аккуратно перемешайте и отмерить 500 мкл суспензии на две предварительно взвешенные трубы Эппендорф. Побочные клетки вниз при 10000 х г в течение 1 мин, аспирации средствах массовой информации, и вес гранул. Рассчитайте общую доходность влажной массы и белка.
11. Плита клетки в стерильный 35 блюд мм культуру в плотности 1 мг белка / блюдо использования без глюкозы DMEM/F12 среды. Культуры клеток в 2 мл глюкозы без DMEM/F12 среде всегда на орбитальном шейкере в инкубаторе при температуре 37 ° C (95% воздуха / 5% CO _2). ^1,2

2. Проксимальных почечных культуре клеток Трубочка

1. Культуральной среде является смесь 50:50 DMEM и Хэма F-12 питательной смеси без фенола красного, пирувата и глюкозы, с добавлением 15 мМ NaHCO _3, 15 мМ HEPES, и 6 мм лактата (рН 7,4, 295 мосмоль / KGH ₂ O). СМИ дополнены L-аскорбиновая кислота-2-фосфат (50 мкм), бычьего инсулина (10 нМ), человеческий трансферрин (5 мг / мл), гидрокортизона (50 нМ) и селен (5 нг / мл) непосредственно перед ежедневно, смена средств массовой информации.
2. Аспирируйте старых средств массовой информации из блюд с использованием стерильной техники. Добавить 2 мл теплой, свежей СМИ, чтобы каждое блюдо использованием стерильной техники. Ревнутренней клетки проксимальных канальцев (РПТС) достигают слияния примерно через 5-6 дней после посева. ^1,2

3. Аденовирусная инфекция из РПТС

1. Аденовирусной инфекции проводится в сливающиеся, покоя культур РПТС после ежедневного изменения средств массовой информации. Доминирующие отрицательные PKC-ε мутант (dnPKC-ε) был построен замены: 1) лизин, аргинин в положении 436 из АТФ-связывающим сайтом и 2) аланина с глутамата в положении 159 из pseudosubstrate области. Эти мутации уничтожил активности киназы конструкцию без изменения активной конформации PKC-ε ^3. PKC-ε было сделано постоянно активный по удалению остатков 154-163 его ингибирующее области pseudosubstrate ^4.
2. Добавить маточного раствора аденовируса проведения caPKC-ε кДНК или dnPKC-ε кДНК, чтобы каждое блюдо для получения желаемого множественности заражения (МВД), в результате значительного увеличения PKC-и Epsilна, уровни белка. Инкубируйте РПТС с аденовируса в течение 24 часов. Изменение средств массовой информации и культуры клеток в течение еще 24 часов. Значительное повышение уровня фосфорилированного и общей PKC-ε белки могут быть получены с использованием 25-50 МВД аденовирусных векторов кодирования caPKC-ε. Большой МВД результаты в еще больший рост уровня активной PKC-ε, но это не рекомендуется РПТС в связи с быстрым клеточной смерти и потери. Значительное повышение уровня неактивный PKC-ε белок может быть получен с использованием 50-100 МВД в РПТС без образования побочных эффектов ^5.
3. Через 48 часа после заражения, аспирата СМИ, мыть монослоев с PBS, а также сбор клеток для иммуноблот-анализ для определения уровня белка ПКС-ε ^5.

4. Измерение РПТС дыхания

1. Подготовка буфером для измерения состояния 3 дыхания (120 мМ KCl, 5 мМ KH ₂ PO _4, 10 HEPES мм, 1 мм MgSO ₄ и 2 мм, напримерTA, рН 7,4). Для измерительного комплекса I-связанных состояние 3 дыхание, дополняют буфером 5 мМ глутамата, 5 мМ малат и 0,1 мг / мл дигитонина. Для сложных II связью состояние 3 дыхание, дополняют буфером 10 мМ сукцинат, 0,1 мкМ ротенон и 0,1 мг / мл дигитонина. Для сложных IV связью состояние 3 дыхание, дополняют буфером с 1 мМ аскорбиновой кислоты, 1 мМ N, N, N ', N'-тетраметил-п-фенилендиамин (TMPD) и 0,1 мг / мл дигитонина. Место решения в 37 ° C водяной бане.
2. Аспирируйте СМИ от культуры блюдо, содержащее РПТС монослоя, добавить 2 мл теплого состояния 3 дыхание буфера, аккуратно соскоблить клетки от блюда с использованием резиновой полицейский, и передать подвески в камеру потребление кислорода оснащен Clark тип электрода.
3. Измерение состояния 2 дыхания (в отсутствие ADP). Инициировать состояние 3 дыхания путем добавления АДФ в конечной концентрации 0,4 мм. Инициировать состояние 4 дыхания, добавив олигомицином до конечного концентрATION 0,5 мкг / мл. Несвязанных дыхания измеряется путем добавления 0,5 мкМ FCCP в клетки дышащих в состоянии 3. ^6,7
4. Сбор клеточной суспензии из камеры осаждения белков использованием хлорной кислоты, и спином вниз осадок. Определение концентрации белка в клеточных гранул.

5. Анализ митохондриальной мембранный потенциал (ΔΨm)

1. Подготовка 0,5 мМ JC-1 решение в стерильной среде культуры.
2. Добавить медленно 20 мкл JC-1 решение каждое блюдо для получения конечной концентрации 5 мкМ. Swirl блюдо для смешивания красителей тщательно. Вернуться блюд в инкубатор на 30 мин.
3. Положить блюда на льду, аспирата СМИ, и мыть монослоев дважды с ледяным PBS. Аспирата PBS, добавить 1 мл свежего PBS, очистить клетки от тарелки и передавать их в трубки Эппендорф. Разбейте монослоев на отдельные клетки с помощью пипетки вверх и вниз.
4. Побочные подвески вниз, при 1000 мкг в течение 2 мин, жерехсердитый супернатант, добавить 1 мл PBS в осадок и вновь приостановить его для получения суспензии отдельных клеток. Повторите этот шаг еще раз, если это необходимо.
5. Побочные клетки вниз на уровне 1000 мкг в течение 2 мин, аспирации супернатант, добавить 0,5 мл PBS, и вновь приостановить гранул. Анализ флуоресценции проточной цитометрии с использованием возбуждения 488-нм аргон-ионный лазер. Читайте выбросов в двух отдельных каналов, FL1 при 525 нм и FL2 при 590 нм. Митохондриальная мембранный потенциал выражается в FL2/FL1 отношение флуоресценции ^6.

6. Выделение митохондрий

1. Подготовка изоляции буферов: буфер (10 мМ HEPES, 225 мМ маннит, 75 мМ сахарозы, 0,1 мМ EGTA, рН 7,4), буфер B (буфер содержащий ингибиторы протеазы, 1 мМ Na ₃ VO _4, 1 мМ NaF), и буфер C (10 мМ HEPES, 395 мМ сахарозы, 0,1 мМ EGTA, рН 7,4). Выполните все шаги на льду.
2. Вымойте РПТС монослоев дважды ледяным буфером PBS. Очистите монослоев в пробирки Eppendorf и спина ихпри 500 мкг в течение 5 мин. Промойте осадок в 1 мл буфера А.
3. Повторное приостановить осадок в 1 мл буфера B, и передать подвески 2 мл Dounce гомогенизатора.
4. Однородный клеток в Dounce гомогенизатор, пока большая часть клеток в гомогенат разбиты, когда проверяется под микроскопом.
5. Центрифуга гомогената при 1000 х г в течение 5 мин при 4 ° C. Сбор супернатант и спином вниз при 15000 х г в течение 10 мин при 4 ° C.
6. Удалите супернатант и вновь приостановить осадок, содержащий сырую митохондрий в 1 мл буфера C. Побочные супернатантов вниз при 15000 х г в течение 10 мин при 4 ° C. Повторите промывку осадка еще два раза ^5.
7. Для измерения деятельности дыхательных комплексов, вновь приостановить митохондриальной гранул в 50-100 мкл буфера для анализа и заморозить в жидком азоте. Разморозить образцы медленно на льду.

7. Измерение активности NADH-убихинон оксидоредуктазы (комплекс I)

1. Подготовка буфере: 10 мМ KH ₂ PO _4, 5 мМ MgCl _2, рН 7,2. Добавить жирные кислоты без BSA и NADH для получения конечной концентрации 0,25% и 0,25 мм, соответственно. Добавить 2 мкл антимицином раствора (1 мг / мл) до конечной концентрации 2 мкг / мл.
2. Выполнить образцов в 48-и прозрачной пластиной. Включить контрольный образец, который имеет все дополнения, но не митохондрий. В каждую лунку, добавить 500 мкл буфера для анализа с дополнениями и митохондрий, и инкубировать пластин при 30 ° C при перемешивании в течение 5 мин.
3. Запустить реакцию добавлением 10 мкл 3,25 мм убихинона в каждую лунку. Измерить абсорбцию (340 нм) в течение 3 мин в 20-секундными интервалами. Добавьте 5 мкл ротенон раствора (1 мг / мл) в каждую лунку и записывать абсорбции для дополнительных 2 мин. Рассчитать комплекс I деятельность в качестве ротенон чувствительных к окислению НАДН ^7.

8. Измерение активности сукцинат-убихинон оксидоредуктазы (комплекс II)

1. Подготовка буфере, содержащем 0,25% жирных кислот без BSA, 20 мМ калий-сукцинат, 0,25 мМ 2,6-dichloroindophenol, 2 мкг / мл антимицином и 10 мкг / мл ротенон.
2. Выполнить образцов в дубликатах в 48-и прозрачную пластину в том числе контрольный образец, который имеет все дополнения, но не митохондрий. В каждую лунку, добавить 500 мкл буфера для анализа с дополнениями и митохондрий, и инкубировать пластин при 30 ° C при перемешивании в течение 2 мин.
3. Запустить реакцию добавлением 10 мкл 3,25 мм убихинона в каждую лунку. Измерить абсорбцию (595 нм) в течение 3 мин в 20-секундными интервалами. Рассчитать комплекс деятельности II, следуя снижение 2,6-dichloroindophenol ^7.

9. Измерение активности Убихинола-цитохром с-оксидоредуктазы (комплекс III)

1. Подготовка буфером, содержащим 0,1% жирных кислот без BSA, 80 мМ калий-сукцинат, 10 мкг / мл ротенон, и 0,24 мм цианистого калия.
2. Выполнить образцыВ дубликаты в 48-и прозрачную пластину в том числе контрольный образец, который имеет все дополнения, но не митохондрий. В каждую лунку, добавить 291 мкл буфера для анализа с дополнениями и митохондрий, и инкубировать пластин при 30 ° C при перемешивании в течение 5 мин.
3. Запустить реакцию добавлением 3 мкл 6 мм окисленного цитохрома с в каждую лунку. Измерить абсорбцию (550 нм) в течение 3 мин в 20-секундными интервалами. Добавьте 5 мкл антимицином раствора (1 мг / мл) в каждую лунку и записывать абсорбции для дополнительных 2 мин. Рассчитать сложной деятельности III, как антимицином чувствительных цитохрома с сокращением ^7.

10. Измерение активности цитохромоксидазы (комплекс IV)

1. Подготовьте уменьшить цитохрома с добавлением натрия аскорбат до 9 мм решению цитохрома С и диализа решение в течение ночи при 4 ° С в 1 л фосфатного буфера (10 мМ KH ₂ PO _4, рН 7,2), содержащем 5 мМ MgCl _2. Подготовить анализ буфер, содержащий0,1% жирных кислот без BSA и антимицина (2 мкг / мл).
2. Выполнить образцов в 48-и прозрачную пластину в том числе контрольный образец, который имеет все дополнения, но не митохондрий. В каждую лунку, добавить 233 мкл буфера для анализа с дополнениями и митохондрий, и инкубировать пластин при 30 ° C при перемешивании в течение 5 мин.
3. Запустить реакцию добавлением восстановленного цитохрома с (90 мкМ конечная концентрация). Измерить абсорбцию (550 нм) в течение 3 мин в 20-секундными интервалами. Добавить 2 мкл раствора цианистого калия (8 мкг / мл) в каждую лунку и записывать абсорбции в течение еще 2 мин. Рассчитать сложной деятельности IV, как KCN-чувствительных окисления цитохрома С ^7.

11. Измерение активности F ₀ F _{1-АТФазы} (АТФ-синтазы)

1. Подготовка F ₀ F _{1-АТФазы} буфером (10 мМ Трис-HCl, 200 мМ KCl, 2 мМ MgCl _2, рН 8,2). Повторное приостановить митохондриальной окатышей в буфере, заморозить образцы митохондриальной в Liquiг азота и оттаивания образцов медленно на льду.
2. Выполнить образцов в трех повторах в 48-и прозрачной пластиной. Для каждой группы лечения, 2 скважины будут работать для измерения суммарной активностью АТФазы (275 мкл буфера для анализа, 5 мкл митохондриальной суспензии, и 5 мкл 95% этанола) и 1 скважина для измерения олигомицином регистра АТФазы (275 мкл буфером, 5 мкл митохондриальной суспензии, и 5 мкл 1 мг / мл олигомицином решение в 95% этанола).
3. Инкубируйте образцы при 31 ° С в течение 10 мин при постоянном встряхивании. Добавить 16 мкл 100 мМ ATP раствора (рН 7,0) и инкубировать при 31 ° С в течение 5 мин при постоянном встряхивании.
4. Передача 200 мкл инкубационной смеси в пробирку, содержащую 50 мкл 3 М TCA. Инкубируйте образцы на льду в течение 10 мин и спина их вниз при 10000 х г в течение 5 мин при 4 ° C. Используйте супернатанты и гранул для определения фосфата и белка соответственно.
5. Определить содержание фосфатов в супернатантах помощьюАнализ неорганических фосфатов. Подготовьте 100 мл Реагент Самнер путем добавления 0,88 г FeSO ₄ до 10 мл 3,75 М H ₂ SO ₄ и регулировки до 90 мл H ₂ O. Добавить 10 мл молибдата аммония раствор (0,66 г/10 мл H ₂ O) для решения FeSO ₄ в H ₂ SO _4. Защищать от света.
6. Нагрузка 96-луночный планшет с 50 мкл каждого стандартного фосфата (0 - 1000 мкм KH ₂ PO ₄₎ и 50 мкл каждого супернатанта в двух экземплярах. Добавить 250 мкл реагента Самнер в каждую лунку и инкубировать пластины при температуре 30 ° С в течение 15 мин при постоянном встряхивании.
7. Измерить абсорбцию при 595 нм при комнатной температуре. F ₀ F _{1-АТФазы} определяется путем измерения олигомицину чувствительной выпуска P _я из АТФ, как мы описали выше. ^7,8 Рассчитать общий и олигомицином регистра F ₀ F _{1-АТФазы} деятельности. Для расчета олигомицину чувствительной АТФазы ACTiВиты, вычесть олигомицином регистра деятельности с общей активностью АТФазы. ^8,9

12. Измерение концентрации АТФ в клетке

1. Место культуры блюд, содержащих РПТС монослоев на льду, аспират среды, и мыть монослоев в два раза со льдом буфера холодного PBS. Добавить 1 мл PBS, чтобы каждый монослой, очистить каждый монослой в PBS, и собирают суспензию клеток в пробирке Эппендорф. Побочные Эппендорфа в микроцентрифуге в течение 5 сек.
2. Определить содержание АТФ в каждой РПТС образца люциферазы метод с использованием биолюминесценции АТФ набор для анализа HS II (Roche) и протоколом производителя. Определение концентрации белка в каждом образце и расчета концентрации АТФ мг белка ^8.

13. Визуализация митохондриальной Морфология

1. Изменить культуру средств массовой информации. Добавить 2 мкл 100 мкМ раствора MitoTracker Красный 580 до каждого блюда (конечная концентрация. 100 нМ) и вернуться к блюдам incubatoг в течение 30 мин.
2. Изучите живой монослоя под флуоресцентным микроскопом с использованием объектива погружения в воду ^5.

14. Анализ жизнеспособности клеток

1. В 24 часов перед началом анализа подготовить 50 мМ раствор цисплатина для лечения клетки, которые будут служить в качестве положительного контроля для апоптоза (аннексина V-положительных клеток). Кроме того, подготовить 500 мМ раствор трет-бутилгидропероксид лечить клетками, которые будут служить в качестве положительного контроля для oncosis (пропидия йодо-положительных клеток).
2. Лечить 2 блюда с 2 мкл 50 мМ цисплатин и 2 блюд с 2 мкл 500 мМ трет-бутилгидропероксид. Посвятите 1 блюдо для не-пятно контроля.
3. В 24 часов после лечения цисплатином и TBHP, подготовить буфера для связывания (10 мМ Hepes, 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl _2, 1,8 мМ CaCl ₂₎ и пропидия йодида (PI) решение (50 мкг / мл) в связывающем буфере.
4. Вымойте монослоев один раз с обязательным баффэ. Добавить 1 мл ледяного буфера и 50 мкл PI решение каждого блюда, за исключением не-пятно и аннексина V-положительных клеток. Крышка блюд и инкубировать на льду в течение 15 мин с нежным орбитальной встряхивании.
5. Вымойте монослоев с буфером для связывания (10 мин) и добавьте 1 мл буфера для связывания и 2 мкл аннексина V-FITC решение каждого блюда, за исключением не-пятно и PI-положительных клеток. Крышка блюд и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин с нежным орбитальной встряхивании.
6. Аспирируйте буфера и мыть монослоев с 1 мл ледяного буфера для связывания на льду в течение 10 мин с нежным орбитальной встряхивании. Повторите стадии промывки.
7. Аспирируйте буфера для связывания и добавить 500 мкл буфера для связывания к каждому блюду. Аккуратно очистить клетки, используя резиновые полицейский и передать клеток проточной цитометрии труб. Дисперсные клеток в суспензии отдельных клеток с помощью пипетки образцы вверх и вниз. Разбейте любую ячейку кластеров.
8. Количественная PI и аннексина V-FITC флуоресценции сразу FloW цитометрии с использованием возбуждения при 488 нм и эмиссии при 590 и 530 нм для ИП и FITC, соответственно. Граф 10000 событий для каждого образца.
9. Положить FITC флуоресценции на оси Х и флуоресценции PI на Y-оси потока цитометрии цифры точкой сюжета. Клетки положительным для аннексина V и отрицательным для PI считается апоптоза. Клетки для положительных и отрицательных PI для аннексина V считают онкотического. ^10,11

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Рисунок 1 показывает, что аденовирусная доставки кДНК, кодирующих конститутивно активный (caPKC-ε) и неактивных (dnPKC-ε) мутантов PKC-ε приводит к значительно увеличились уровни белка ПКС-ε в РПТС и в митохондриях. Клетки, инфицированные с кДНК проведения caPKC-ε вектор экспрессия фосфо...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Здесь подход позволяет избыточная экспрессия отдельных изоферментов PKC в первичной культуре почечных проксимальных канальцев клеток. Есть несколько сильных сторон этого подхода: 1. Это позволяет для исследования механизмов регулирования в однородной популяции клеток (почечные клетк...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге
Ламинарном потоке	Thermo Electron Corporation	FORMA 1104
2 мл и 15 мл Dounce ткани мясорубку	WHEATON	989-24607, 357544
85 и 235 микрон нейлоновая сетка	Мелкие детали	CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD
50 мл стерильной пробирке центрифуги	BIOLOGIX	BCT-P 50BS
1,5 мл микро труб	Sarstedt	72.690.001
35 х 10 мм, стерильные чашки культуры	Гранулирование	430165
Центрифуга Jouan	Jouan	Jouan CR3 11175704 Роторы: Jouan T40
Регулируемые микро-центрифуге	SIGMA	Модель 1 - 15
Биологические Монитор кислорода	YSI Объединенного	YSI Model 5300A
Однокамерные Micro кислородная система	YSI Объединенного	5356S
Кислородный датчик	YSI Объединенного	5331A
Циркуляционные ванны	YSI Объединенного	5310
KCl и стандартный набор мембранных	YSI Объединенного	5775
Магнитная мешалка	YSI Объединенного	5222
Планшетный Recorder	Kipp & Zonen	BD 11E
48-и и 96-и прозрачных пластин	Costar	3548, 3679
Thermomixer R	Миppendorf	5355 21919
Орбитальный шейкер MAXQ 2000	Thermo Scientific	Шка 2000
Spectra FLUOR Plus (поглощение / флуоресценции / люминесценции читателя)	Tecan	F129005
С водяной рубашкой США Autoflow автоматического CO 2 инкубаторе	NUAIRE	NU 4850
12x75 мм полистирола культуры пробирки для проточной цитометрии	Марка Фишера	14-961-20
Axioskop Цель воде погружения 63x / 0,90 W	Carl Zeiss	114846 ACHROPLAN 44 00 67
DMEM / F12	Cellgro	99 - 830 - PB
DMEM / F12 Хэма	Сигма	D 2906 - 1л
Дефероксамин мезилата	БольницахРА	D110
Коллагеназы типа I	Worthington	4196
Ингибитора трипсина	Сигма	T 6522 - 500 мг
5,5 ', 6,6'-тетрахлор-1, 1 ', 3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine йодида (JC-1)	Invitrogen	T3168
Mitotracker красный	Invitrogen	M22425
ATP Биолюминесценция набор для анализа HS II	Roche	11 699 709 001
Аннексина V - FITC решения	BioVision	1001 - 200
Проточный цитометр	BD Biosciences	BD FACSCalibur