Мониторинг репликации плазмиды в клетках млекопитающих Онлайн над несколькими поколениями с помощью флуоресцентной микроскопии

Резюме

Метод наблюдения отдельных молекул ДНК в живых клетках описано. Метод основан на связывании флуоресцентно меченый белок-репрессор лак для сайтов связывания разработаны в ДНК интерес. Этот метод может быть адаптирован к следуют многие рекомбинантные ДНК в живых клетках с течением времени.

Аннотация

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies ^1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres ^4-8.

Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.

Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest ⁹. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.

This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase¹⁰. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes¹¹. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

протокол

1. Инженерная клеток с видимой Плазмиды

1. Используйте стандартные пищеварения ограничение или гомологичной рекомбинации методов ввести фрагмент ДНК, содержащий около 250 копий лактозы последовательности операторов (Laco) в плазмиду для визуализации. Наши плазмида BACmid около 170 т.п.н. и содержит весь геном саркомы связанных Вирус герпеса Капоши (KSHV) и кодированных устойчивость к гигромицину ^12.
2. Представьте Laco содержащие плазмиды ДНК в клетки млекопитающих путем трансфекции с Lipofectamine 2000 года. Мы трансфицировали HeLa и SLK клеток в 60 мм блюд в течение 4 часов с 10 мкг очищенной ДНК плазмиды с 25 мкл Lipofectamine 2000 году, 0,5 мл OptiMEM, и 3,5 мл DMEM.
3. Изменение культуральной среде до 5 мл DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки и инкубируют клетки в течение 48 часов.
4. Пластина клеток при низкой плотности в больших блюдах и культуре клеток в среде, содержащей антибиотик выбора для введенных плаСМИД, мы выбрали клеток в DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки с 300 мкг / мл гигромицину в течение 3 недель.
5. Используйте куски стерильные, трипсина пропитанной фильтровальной бумаги для передачи гигромицину устойчивых колоний в новых блюд культуры.
6. Когда трансфицированные клоны выросли, чтобы заполнить блюдо, выделить ДНК для ограничения пищеварения и Саузерн-блоттинга для того, чтобы полимер Laco плазмиды является однородным и ожидаемого размера.
7. Если плазмиды не был спроектирован, чтобы выразить слияния LacI, заразить подходящих клонов с ретровирус, кодирующий репрессор лактозы (LacI), слитый с красным флуоресцентным белком, такие как LacI-tdTomato. Мы используем tdTomato, а не белки, которые светятся ближе к зеленым, чтобы минимизировать photoxicity, что будет происходить из нескольких экспозиций в течение длительного времени ^13.
8. Как только белок LacI слияния вводится, культуре клеток в присутствии 200 мкг / мл изопропилового-BD-тиогалактозида (IPTG), чтобы заблокировать слияние белков из обязательныхДНК.
9. Культуры клеток в течение не менее 3 дней, чтобы выражение LacI-tdTomato белка.
10. Экран клонов (путем вымывания IPTG и просмотр клеток, как описано ниже) для тех, с оптимальным уровнем LacI-tdTomato, которые показывают различные сигналы с минимальным уровнем фона несвязанного слитого белка.

2. Развитие Imaging System

Наша система формирования изображений состоит из Zeiss Axiovert 200M оснащена моторизованной сцене и план-Aochromat 63x/1.4 нефти цели. Флуоресцентный свет возбуждения осуществляется "нейтральный белый" Светодиодные системы Colibri. Выбросы обнаруживается CascadeII: 1024 EMCCD камеры. Это охлаждением, бэк-разбавленной камера с усилением регистр для усиления сигналов; темные ток 0,061 электронов на пиксел в секунду, а квантовая эффективность больше, чем 0,90. Система управляется с помощью AxioVision 4,8 программного обеспечения, включая модуль SmartExperiments. Для обнаружения tdTomaмы используем, чтобы Zeiss 75HE набор фильтров, для которых 85% прошли свет может возбуждать фтор и 95% излучаемого света будет проходить выбросов фильтр.

1. Сборка системы формирования изображения с помощью инвертированного микроскопа и камеры для EMCCD чувствительны обнаружения сигналов, светодиодный источник света для конкретных возбуждением и быстрым опалубка, моторизованный фокус сцене и руки, и программное обеспечение управления для автоматизированного приобретения изображений в течение длительных промежутков времени с несколькими Z-стеки. Система должна сидеть на воздухе стол, который будет изолирован от вибраций.
2. Соберите этап-топ инкубаторе для поддержания клеток при 37 ° C, 5-10% CO ₂ в увлажненной камере. Разрешить достаточно времени для системы, чтобы прийти к стабильной температуры, чтобы минимизировать движение артефакты во время эксперимента.
3. Используйте подогревом ошейник для целей, чтобы предотвратить несанкционированный цели из тепла от образца.

3. Визуализация меченой ДНК

1. Пластина клеток в 35 ммсо стеклянным дном блюдо с плотностью менее 10% слияния, которое позволит пары клеток к делению в колонии 8-16 клеток без перекрытия. Сделайте это, по крайней мере, 24-48 ч перед изображениями так, что жизнеспособные клетки есть время, чтобы разделить.
2. От одного до трех часов до начала обработки изображений, промыть пластины 3 раза культуральной среде которых не хватает как селективные препараты и IPTG. Эта процедура смывает нежизнеспособных клеток и позволяет LacI слитых белков связывать Laco сайтов в плазмиды.
3. Заменить культуральной среде с 2 мл DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 25 мМ HEPES.
4. Замените верхнюю часть культуры блюдо с CultFoil растягивается в кольцо крепления для 35 мм блюдо. Это покрытие будет препятствовать испарению культуральной среды, что позволит увеличить концентрацию соли в течение долгого времени и убить клетки.
5. Использование дифференциального интерференционного контраста (DIC) для просмотра изображений клеток и определить фокальной плоскости верхней и нижней клеток в нескольких полях зрения.В каждом поле перейти к фокальной плоскости примерно 1/3 пути вниз от верхней части клетки. Сохранить X, Y, Z координаты в списке сохраненных позиций этапе.
   Примечание: плазмиды сигналы могут быть не видны через окуляры, когда клетки освещении светодиоды с длиной волны подходят для гибридного белка LacI. Слабые сигналы могут быть виден только с использованием EMCCD камера, которая позволяет интегрировать сигнал с течением времени и таким образом эффективно усиливает слабые сигналы.
6. В программное обеспечение для управления микроскопом, определяют Z-Stack изображения должны быть выполнены на каждом этапе сохранено положение. Выберите аз шаг размере 0,35-0,50 мкм, которая позволит вам приблизить Найквиста в размерности г ^14. Включите «лишних» ломтиков выше и ниже плоскости, в которой клетки находятся, эти кусочки позволяют выявлять следующие ячейки движения во время клеточного цикла, а также используются в пост-обработке приобретение (деконволюция) изображения стеки. Это включение будетпривести в стек 40-60 изображений, в зависимости от толщины клеток.
7. В программное обеспечение для управления микроскопом, определить время эксперимента серию собрать яркое изображение поля Z-стеки на 30 мин интервалы (для отслеживания клеточного деления и миграции в течение длительного времени) и флуоресцентные изображения на 10-60 минутные интервалы (для визуализации плазмид внутри клеток). Не используйте DIC изображений во время эксперимента, так как он требует больше света, чем стандартные ярких изображений поле, которое может подвергать излишне клеток в фототоксичности в течение долгих экспериментов.
8. Запустите программу-контролируемого эксперимента. Убедитесь, что система не нарушена (столкнулась, подвергаются чрезмерным светом комнате и т.д.) в ходе эксперимента.
9. При необходимости пополнения воды в системы увлажнения во время эксперимента.

4. После приобретения обработка изображений

1. Просмотрите изображения для каждого Z-Stack и момент времени. Обрезать ненужные областиизображения для сокращения времени компьютерной обработки на следующем этапе.
2. Использование алгоритма деконволюции повторно назначить интенсивности сигнала на пиксель происхождения в каждом Z-Stack ^15. Хотя это деконволюция может быть основана на теоретическом функции размытия точки для системы формирования изображения, предпочтительнее для измерения функции точки распространения вашей системы визуализации флуоресцентных микросфер, и использовать это измерение в деконволюции алгоритм. Мы измерили функцию рассеяния точки нашей системы формирования изображения и применять ограничения максимального правдоподобия итерационный алгоритм в AxioVision программного обеспечения (AxioVision описание программного обеспечения, Zeiss).
3. Изучите изображение, чтобы отслеживать изменения интенсивности движения и плазмид во время клеточного цикла и разбиение плазмиды в дочерних клетках.

Результаты

Максимальная прогнозов интенсивности Z-стеки, приобретенных в результате представителем эксперимента представлены на рисунке 3. Типичные плазмиды сигналы присутствуют в 3-8 ломтика Z-Stack, в зависимости от того, представляют одну или кластеров плазмид. В случае EBV и KSHV получен...

Обсуждение

Метод, описанный здесь, может использоваться следовать плазмид в живых клетках млекопитающих с течением времени, охватывающих несколько поколений. По ограничению воздействия возбуждающего света, мы использовали эти методы, чтобы следить клетки вновь разделились парами через 16-32 коло...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
DMEM	GIBCO	11965
OptiMEM	GIBCO	31985
Эмбриональной бычьей сывороткой	Hyclone	SH30910.03
Пенициллин	Сигма	P3032
Стрептомицина сульфат	Сигма	S9137
Гигромицину	Calbiochem	400050	400 мкг / мл для SLK, 300 мкг / мл для HeLa
Изопропиловый-BD-тиогалактозида (IPTG)	Roche	10 724 815 001	Конечная концентрация 200 мкг / мл
Липофектамина 2000	Invitrogen	11668-027
HEPES	GIBCO	15630
Со стеклянным дном блюда	Маттек	P35G-1.5-10-C
CultFoil	Pecon	000000-1116-08
Axiovert 200M	Zeiss
Колибри	Zeiss	423052-9500-000
Нейтральный белый светодиод	Zeiss	423052-9120-000
Фильтр Cube 75 он	Zeiss	489075-0000-000
План-Apochromat 63x/1.4 цели	Zeiss	440762-9904-000
CascadeII: 1024 EMCCD камеры	Фотометрия	B10C892007
Tempcontrol мини-	Zeiss / Pecon	000000-1116-070
Tempcontrol 37-2 цифровой	Zeiss / Pecon	000000-1052-320
CTI Контроллер 3700 цифровые	Zeiss / Pecon	411856-9903
Цель нагреватель	Zeiss / Pecon	440760-0000-000
Этап отопления вставки P	Zeiss / Pecon	411861-9901-000
Этап-топ инкубатор S	Zeiss / Pecon	411860-9902-000
Увлажнитель системы	Zeiss / Pecon	000000-1116-065