Bioluminescent Бактериальные изображений<em&gt; В Vivo</em

Резюме

В этой статье описывается управление Люкс-отмеченных Бактериями мышей и последующее В естественных условиях Анализ с использованием ИВИС биолюминесценции изображений.

Аннотация

Это видео описывает использование всего тела bioluminesce томография (BLI) для изучения бактериальных торговле живыми мышами, с акцентом на использовании бактерий в генной и клеточной терапии рака. Бактерии, присутствующие привлекательной класс вектор для лечения рака, обладающие природной способностью расти преимущественно в опухоли после системного введения. Бактерии инженерии, чтобы выразить кассеты люкс гена разрешения BLI обнаружения бактерий и одновременно опухоли сайтов. Расположение и уровень бактерий в опухоли с течением времени могут быть легко рассмотрены, визуализировали в двух или трех измерениях. Метод применим для широкого спектра бактериальных видов и типов опухолей ксенотрансплантата. В данной статье описывается протокол для анализа биолюминесцентного бактерий в подкожной опухоли мышей подшипника. Визуализация синантропных бактерий в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) от BLI также описан. Это мощный и дешевый, изображений в реальном времени стратегия предTS идеальный метод для изучения бактерий в естественных условиях в контексте исследования рака, в частности генной терапии и инфекционных заболеваний. Это видео описывает процедуру для изучения люкс с метками E. палочки в живых мышей, что свидетельствует о пространственной и временной отсчет достижимо использованием BLI с системой ИВИС.

протокол

1. Опухоль индукционные

1. Для обычных индукции опухоли, минимальная доза онкогенных клеток суспендируют в 200 мкл бессывороточной культуральной среде вводили подкожно (п) во фланг инфекцию бесплатный 6-8 недельных самок BALB / C или бестимусным MF1-nu/nu мышей п = 6 (Harlan, Оксфордшир, Великобритания) (1 х 10 ⁶ клеток 4T1) с использованием 21-калибровочного иглы шприца. Жизнеспособность клеток, используемых для посева было больше, чем на 95%, как это определено количество визуальных использованием гемоцитометра и Трипановый Синяя краска исключения (Gibco).
2. После создания опухоли, опухоли было позволено расти и развиваться и наблюдали дважды в неделю. Объем опухоли вычисляли по формуле V = (AB ²⁾ Π / 6, где находится самый большой диаметр опухоли и B является самой длинной диаметра, перпендикулярного диаметра.

2. Бактериального препарата

1. Бактериальный штамм, используемый в этом protocoЯ был E. соН К-12 MG1655, небелковой-токсин, экспрессирующих штамм, укрывательство luxABCDE кодирования плазмиды, которая позволяет бактериям быть обнаружены BLI. E. палочки MG1655 содержащие интегрированный luxABCDE был выращен в аэробных условиях при 37 ° С в среде LB (Sigma-Aldrich, Ирландия) с добавлением 300 мкг / мл эритромицина (Em). Биолюминесцентного производной MG1655 был создан с помощью плазмиды p16S люкс, который содержит учредительные _HELP P luxABCDE оперона ^1.
2. Для подготовки введения мышам, культуры инкубировали в среде LB при 37 ° C в шейкере со скоростью 200 оборотов в минуту до середины логарифмической фазы (оптической плотности при 600 нм). Бактерии собирают центрифугированием (6000 х г в течение 5 мин), промывают PBS (Sigma), и разводят в PBS 1 × 10 ⁷ колониеобразующих единиц (КОЕ) / мл для внутривенного введения, или 1 х ¹⁰ 10 для принудительного кормления.

3. Бактериальные администрацииния

1. Мыши были произвольно разделены на экспериментальные группы, когда опухоль достигает примерно 100 мм ³ объема. Для внутривенного введения, сдержанный мышей каждый получил 10 ⁶ клеток в 100 мкл, вводится непосредственно в латеральную хвостовую вену помощью 28G иглу шприца. Количество жизнеспособных каждой посевной определяется ретроспективным покрытием.
2. Для исследования желудочно-кишечного тракта колонизации, 10 ⁹ бактериальных клеток вводили перорально в 100 мкл на мышь через желудочный зонд, три дня подряд. Ранее существовавшие комменсальной бактериальной уровни снизились до подачи добавлением 5 мг / мл стрептомицина в мышь питьевой воды в течение 7 дней до начала желудочный зонд ^1.

4. Биолюминесценции изображений

1. 2D в естественных условиях BLI изображений проводили с использованием IVIS100 (суппорт). В определенных временных точках сообщение бактериальной администрации, мышей анестезировали использованием XGI-8 суппорт газа анестезииСистема с 3% Isofluorane, и все тело изображение анализ был проведен в ИВИС 100 система в течение 2-5 мин при высокой чувствительности.
2. Для визуализации 3D, анестезированных мышей были помещены в трансфера мыши изображений внутри оптической системы визуализации для спины томография (ИВИС Spectrum, суппорт). Для получения изображения бактериальной люциферазы сигнала для 3D-оптических реконструкции, фильтр твердых диапазоне длин волн 500-580 нм были использованы с бен приобретение 16 раз по 3-4 мин на фильтр, чтобы максимизировать отношение сигнал-шум. В рамках этой последовательности захвата изображений, структурированные изображения света было получено для определения высоты карте. Эта карта была введена рассеянный свет томографии (DLIT) реконструкций алгоритмов, которые были использованы для формирования 3D-изображения с помощью оптического неотрицательных наименьших квадратов оптимизации ^2.
3. Анализ изображений: Регионы интересов были определены и количественно, используя программное обеспечение Живые изображения (суппорт).

5. ПредставительРезультаты

В этом исследовании, непатогенные синантропных бактерий E.coli K-12 MG1655 выражения luxABCDE оперона была IV вводили мышам подкожно опухолями 4T1 ксенотрансплантата. Бактериальные люкс сигнал был обнаружен в частности, в опухоли мышей сообщению IV-администрирования (рис. 2). Культура восстановления бактерий из образцов мышей подтверждает существование линейной зависимости между жизнеспособных бактерий номера и количество света обнаружено (рис. 3). В естественных изображений перорального синантропных бактерий в ЖКТ достигается также с помощью 3D BLI.

Рисунок 1. Протокол Timeline. Подкожные опухоли индуцированные у мышей и бактерий вводили при развитии опухоли (100 мм ^3). Онлайн мышей BLI имв возрасте в различных временных точках сообщение бактериальной администрации (стрелки отображения типичных раза).

Рисунок 2. Администрация E. палочки MG1655 luxABCDE опухоли мышей подшипника. Подкожный 4T1 опухоли индуцированные в MF1 Nu / Nu мышей и E. палочки MG1655 luxABCDE вводить на развитие опухоли. Каждое животное получало 10 ⁶ клеток вводится непосредственно в боковую хвостовую вену. Мыши были обследованы в четырех временных точках в ходе исследования (черные точки оси и изображения) с последующей восстановление жизнеспособных бактерий (КОЕ) из опухолей образца жертву мышей (гистограмма). Увеличение числа и бактериальные плазмиды экспрессии генов, в частности, в опухолях наблюдалась в течение долгого времени (представительных мышей показано на момент времени). Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 3. Отношения между внутриопухолевые бактериального числа и биолюминесценции. Жизнеспособных бактерий в опухоли были перечислены экс естественных условиях бактериальные культуры от опухоли после BLI в различные моменты времени пост IV администрации. Вход значения бактериального числа (КОЕ) по отношению к bioluminesce в естественных единицах на графике. Надежная корреляция между бактерий и бактериальных сигналы биолюминесценции наблюдаются R ² = 0,9717 ^1.

Рисунок 4. 3D ИВИС изображения мышиного желудочно-кишечного тракта колонизирована E. палочки MG1655. GIT мышей была колонизирована перорального введения 10 ⁹ КОЕ E. палочки в течение трех дней подряд. Пример изолированного изображения с 3D-томографии колонизировали мышь показано на рисунке.3D-изображения показывают цифровой атлас мыши скелета обеспечить анатомическую регистрации. E. палочки MG1655 биолюминесценции видна в зеленый при более низких, и фиолетовый на более высоких уровнях.

Обсуждение

В контексте генной терапии, использование биологических агентов для доставки терапевтических генов для пациентов показало большие надежды ^3-5. Подобно вирусам, врожденные биологические свойства бактерий условия для эффективной доставки ДНК в клетки или ткани, особенно в контек?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
4T1 клеточной линии	ATCC	CRL-2539	Сингенных модели рака молочной железы, полученных от спонтанно возникающих BALB / C опухоли молочной железы
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429	Дульбекко изменения Орла Средний
PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Фосфатным буферным раствором
Xenogen ИВИС	Суппорт Life Sciences		ИВИС 100 для 2D изображений; ИВИС Spectrum для 3D.
Лурия бульон Миллер (LB)	Sigma-Aldrich	L2542	Рост средой для E. палочки
Эритромицин	Sigma-Aldrich	E5389	Антибиотик
Стрептомицин	Sigma-Aldrich	S9137	Антибиотик
MF1nu/nu мышей	Харлан (UK)	069 (ню) / 070 (Nu / +)	Hsd: Бестимусным Nude-Foxn1nu
BALB / C мышей	Харлан (UK)	066	Гаплотипа: H-2 D
Желудочный зонд иглы	Vet-Tech Solutions (UK)	DE009	22G х 38 мм прямой зонд иглы
Шприц для инъекции IV	BD Biosciences	309309 - 1 мл	Инсулиновый шприц с 28 х G ½ дюйма микро-тонкой иглой IV.
Шприц для инокуляции опухоли	Braun	9161376V	Omnifix 26 G х иfrac12; дюймовые иглы