Производство и использование контрейлерные Multibarrel Электроды для<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Фармакологические манипуляции нейронных ответов

Резюме

Ионофорез нейронных агонистов и антагонистов во внеклеточной В естественных условиях Записи является мощным средством для управления микроокружения нейронов. Эти манипуляции легче всего сделать с помощью контрейлерные multibarrel электродов. Здесь мы расскажем, как изготовить их и использовать их во время слуховых записи.

Аннотация

В естественных условиях записей с отдельных нейронов позволяет следователю изучить стрельбы свойств нейронов, например, в ответ на сенсорные стимулы. Нейроны обычно получают несколько возбуждающих и тормозных афферентных и / или эфферентные входов, которые интегрируются друг с другом, и окончательный ответ измерять свойства нейронов приводятся в нейронной интеграции этих входов. Для изучения обработки информации в нейронных системах, необходимо, чтобы понять различные входы нейрона или нервной системы, а также конкретных свойств этих материалов. Мощный и технически относительно простой метод оценки функциональной роли отдельных входа, что данный нейрон получает это динамично и обратимо подавляют или устранить эти входы, и измерить изменения в выходной нейрон, вызванных этой манипуляции. Это может быть достигнуто путем фармакологически изменения ближайшего окружения нейрона с контрейлерные multibarrel электроды. Эти электроды состоят из одного электрода записи баррель, а электрод multibarrel препарат, который может перевозить до 4-х различных синаптических агонистов или антагонистов. Фармакологические препараты могут быть применены iontophoretically в нужное время в ходе эксперимента, что позволяет временем контролируемые поставки и обратимым реконфигурации синаптических входов. Таким образом, фармакологические манипуляции микросреда представляет собой мощный и уникальный метод для проверки конкретных гипотез о нейронных функций цепи.

Здесь мы расскажем, как контрейлерные электроды изготавливаются, и как они используются во время экспериментов в естественных условиях. Контрейлерные система позволяет следователю объединить одним электродом записи баррель произвольного свойства (сопротивление, чаевые размера, формы и т.д.) с электродами наркотиков multibarrel. Это является важным преимуществом по сравнению со стандартными мульти-электродами, где все бочки имеют более или менее одинаковую форму и свойства. Multibarrel электроннойlectrodes впервые были введены более 40 лет назад ^1-3, и претерпел ряд конструктивных усовершенствований ^2,3 до контрейлерные тип был введен в 1980-х годах ^4,5. Здесь мы приводим ряд важных улучшений в лаборатории производства контрейлерные электроды, которые позволяют для глубокого проникновения в мозг нетронутыми в естественных условиях животные препаратов в связи с относительно тонкими электродами вал, который вызывает минимальные повреждения. Кроме того, эти электроды характеризуются низким записи шумов, и имеют низкое сопротивление наркотиков бочках очень эффективным ионофорез нужного фармакологических агентов.

протокол

1. Потяните стеклянные электроды

   Потяните стеклянных электродов
   1. Потяните один электрод баррель. Используйте одно стекло стволом капилляр с нитью и вытащить наконечник диаметром около 1-2 микрон, вал длиной 10-12 мм, и соответствующее сопротивление электрода около 12 МОм (в диапазоне 5-20 МОм) при измерении в 0,9% раствором хлористого натрия. Нижняя сопротивление электрода приведет к более фоновой активности и, следовательно, больше трудностей в выделении унитарных активности отдельных нейронов. Для снятия этого электрода можно использовать любой горизонтальной или вертикальной съемник либо с отоплением нитей или нагревательных спиралей.
   2. Потяните multibarrel электрода. Из-за гораздо большего диаметра multibarrel стекла и необходимость равномерного распределения тепла по всему multibarrel, мощный съемник с большим диаметром катушки отопление, отопление не нити, не требуется. Multibarrel пипетки должен быть вставлен в центр отопления нити с пО свяжитесь с нагревательной спиралью. Заметим, что помимо 5-бочка пипетки описанные здесь, 3-бочка или 7-бочка пипетки являются коммерчески доступными альтернативами. Вытяните стекло пипетки около 10 микрометров общем диаметре, или меньше. Чаевые будут разбиты на правильный диаметр в следующем шаге, поэтому точный размер чаевых не столь важно во время тянуть процесс, чем общая форма кончик электрода, которая должна быть длинной и относительно тонкой. Обратитесь к изображению на рисунке 1С для желаемой формы кончика электрода. Короткие и короткие формы электродов (рис. 1б) вызовет значительное количество повреждения тканей при продвинулись в мозг, в то время как очень длинные и тонкие формы электродов (рис. 1А) будет изгибаться и, следовательно, будет трудно сломать кончик электрода к правильному диаметр (см. шаг 2).

2. Изменить электрода Советы

   Изменить электрода советы. Перед двумя электродами могут быть склеены, Они должны быть изменены. Вал одного электрода должна быть согнута прежде чем он может быть присоединен к multibarrel, чтобы убедиться, комбинированные вал готовой контрейлерные электрод как можно тоньше. Кроме того, кончик электрода multibarrel должна быть прерваны для обеспечения низкого сопротивления для ионофореза.
   1. Изгиб вала одного электрода баррель примерно на 20 градусов. Используйте наименьшее пламени горелки Бунзена возможно. Типичный "малый" Бунзена горелки из стандартных сбытовых компаний создают лабораторию пламени, размеры которых слишком велики для этого приложения. Чтобы обойти эту проблему использовать наименьшее коммерческих горелку и закрепить иглу шприца (~ 18 калибра) в верхней части горелки, и запечатать соединение с помощью стоматологического цемента. При работе, пламя должно быть трудно увидеть, около 5 мм или меньше в диаметре и около 8 мм в высоту. Любое движение воздуха в помещении будет потушить это пламя, так что это хорошая идея, чтобы работать с горелкой взакрытом помещении, или использовать ветер щиты. Перемещение одного электрода баррель через пламя согнуть ее примерно на 20 градусов. Цель иметь пламени горелки расплавить стекло в переходной зоне около 10 миллиметров от торца электрода. Чтобы избежать плавления конца электрода мы полагаем, что электрод проводится при температуре около 45 градусов, острием вниз, и переместите электрод через пламя довольно быстро.
   2. Оторвать кончик электрода multibarrel. Для обеспечения визуального контроля, ломая кончик электрода, с помощью микроскопа с минимальным 10x и 10x цель окуляров. Измерительная шкала установлена ​​в глазной также будут необходимы для измерения размеров чаевых. Прикрепите кусок оргстекла в микроскоп так, что к концу оргстекла можно увидеть примерно в одной трети до половины поля зрения микроскопа. В нашем случае, оргстекла кусок примерно 25 х 70 мм и толщиной 5 мм и прикрепленные с помощью винтов, которые могут быть закреплены в пользовательскомсделал нить в микроскоп. Это важно иметь дизайн, который позволяет оргстекло движущегося независимо от слайда. Поместите multibarrel электрода в слое формовочной глины на предметное стекло и вставить слайд, содержащий электрод в держатель слайдов микроскопа сцены. Использование ху столике микроскопа в манипуляторами, осторожно двигаться кончик электрода против оргстекла кусок, и наблюдать за нарушение кончик через окуляры микроскопа. Попытка чисто сломать кончик multibarrel на совокупный диаметром около 25-35 мкм. Удалите пипетки с диаметром кончика, что прервался слишком большой или советов с неровными перерывов. Отбросим около 30% наших multibarrel электродов в связи с нежелательными формами чаевых.

3. Соберите контрейлерные электродов

   Соберите контрейлерные электрода.
   1. Позиция электродов. Удалить оргстекла часть, используемая в шаге 2,2 из микроскопа. Закрепить завершеноmultibarrel электрода в пластилин на предметное стекло, кончиком, направленным немного вверх. Указывая вверх будет иметь важное значение для шага 3.2, склейка из двух электродов. Советы, которые направлены вверх вызвать клей убежать от кончика, избегая склеивания электрода советы. Вставьте изогнутый ствол один электрод в держатель электрода на заказ микроманипулятора (рис. 2). Используя визуальную ориентацию, а затем микроскопических руководства, опустить один электрод баррель на multibarrel электрода. Один электрод должен быть снижен непосредственно в паз, образованный расположение 5 бочек с ее кончика выступающий кончик multibarrel чаевые примерно 5-10 мкм. При опускании одного ствола, внимательно наблюдать за угол, который образуется между двумя электродами. Для достижения наилучшего результата избежать любых углов, в котором указывают советы друг от друга, а, скорее, попытка снизить одного электрода на несколько совершенно параллельные или даже с его кончикакасаясь multibarrel во-первых, формирование расположение очень небольшое "клин". С одним наконечником баррель является очень гибкой, она будет сгибаться, когда один электрод опускается чуть дальше после того, как кончик достиг верхней поверхности несколькими электродами баррель, образуя чистый композитный наконечник, который имеет небольшое количество пружины построен в что помогает проведению советов вместе. Однако, если угол между одним стволом и multibarrel электрод слишком крутой (слишком много клина), пружины будет слишком высокой и согните вниз электродами.
   2. Клей электрода валов вместе. Клей валы из двух электродов вместе, используя цианакрилатного (суперклей). Поместите небольшую каплю клея на маленькой стороне плоской зубочистки и монтаж сенсорный электрод с клеем капли. Начало в позиции самых дистальных кончиков и постепенно двигаться зубочистку с клеем падение вдоль электродов валы к электроду советы. Использование слишком большого количества клея или нанесения клея тоо близких к электроду советов приведет к склеивания электрода отверстия, что делает электрод крайней мере, частично нефункциональные.
   3. Стабилизация совместно с зубным цементом. Смешайте небольшое количество зубной цемент и стоматологических акриловых в небольшой одноразовой пластиковой посуды или вес лодки, с помощью плоской зубочистки. Подождите, пока цемент становится формовочной и нанесите небольшое количество на стыке между двумя электродами, для стабилизации сустава (розовый материал на рисунке 3). Разрешить около 15 минут, чтобы высохнуть.
   4. Удалите и храните электрод. Аккуратно снимите завершена контрейлерные электрода первым из микроманипулятора держателя, а затем отсоединить от стекло, и в магазине в пыленепроницаемый контейнер.

4. Подготовка электродов Fill решения

   Подготовка электрода заполнения решений. Так как ионофорез требует заряженных молекул, большинство агентов должны быть распущен в кислой или щелочной среде (как правило,та рН около 3-4, или рН около 8-10, соответственно). Количество химических веществ, которые часто используются в ионофорез приведены в таблице 1. Для агентов, которые не указаны в таблице, определить по значению рКа, будет ли она проще в использовании молекул в кислой или щелочной среде, чтобы сохранить молекулы заряжены, и растворить соответственно. Для достижения наилучших результатов, смешать все свежие решения каждый день.

5. Заполните и подготовка электродов

   Заполнить и подготовки электродов. Непосредственно перед использованием электродов, бэк-заполнить каждую бочку с соответствующим препаратом, с помощью углеродного волокна 28 - 34 калибровочных иглы прикреплен к шприцам с шприц фильтры. Заполните 4 внешних баррелей 5-бочка конфигурации с препаратами выбора, и центр бочки с 3М NaCl в качестве уравновешивающего баррель. Заполните один электрод записи бочку с 3М NaCl, а также. Добавление красителя в раствор NaCl, таких как быстрый зеленого или красного фенола будет легче увидеть кончик электродапри размещении электродов на поверхности мозга. Вставьте электрод в держатель электрода в настройки записи и вставить все провода в соответствующие баррелей стекла. Используйте изолированные серебряной проволоки, из которых около 1 см изоляции была удалена на конце. Там должно быть 5 проводов для multibarrel электрода (4 наркотиками баррелей и один балансировка баррель), а также усилитель провод, который должен быть вставлен в записи одного электрода баррель.

6. Включите модули Ионофорез насоса

   Включите модули ионофорез насос и проверить все баррелей. Электродной функции проверки каждого насоса модуль поможет определить, если электрод баррель является функциональным. Для предотвращения утечки наркотиков из бочек, когда он не используется, удержание напряжения в противоположную полярность молекулы заряд должен быть применен.

Результаты

В этом эксперименте, антагонист рецепторов глицина стрихнином гидрохлорид iontophoretically применяется. Блокировка глицинергических торможения обычно увеличивается стрельбы в нейронах. Рисунок 4 показывает пример данных из слуховых нейронов, чьи ответы к синусоидальной звуковых раздражителей возрастающей интенсивности доставлен в уши животного были записаны. Этот тип эксперимента называют разряд нейрона скорость функция интенсивности против. Громкие звуки привело к увеличению всплеск ставок (черная кривая). Начальный ток ионофорез используется во время этого эксперимента был 15 нА. После того, как ток включения и изменения в функции интенсивности скорость стабилизировалась на новом уровне (синяя кривая), выброс тока постепенно увеличивается до 30, 45 и 60 нА (оранжевый, зеленый и голубой кривых, соответственно). В любом случае, ответ нейрона на тот же диапазон интенсивности звука были записаны после изменений в dischaRGE скорости интенсивность функции в ответ на новый текущий выброс стабилизировалась. Наиболее подходящим выброса текущем использовать в этом примере составляет 45 нА до 60 нА, потому что эти уровни тока не изменяют по-разному ответ нейрона. Этот результат позволяет предположить, что на 45 нА ток, глицина все рецепторы нейрона, что уже были заблокированы стрихнин гидрохлорида. Любое дальнейшее увеличение выброса тока и выпуская еще более стрихнин не привело к дальнейшему изменению разряда нейрона скорость на уровне функции. После завершения протокола, выброс ток был выключен. Восстановление нервных реакций обратно в базовый была достигнута примерно через 25 мин (красная линия). Это может занять, в зависимости от типа и количества лекарственного средства выбрасываются, между нескольких секунд до нескольких десятков минут.

Наркотик	Концентрация	рН раствора	Растворитель	Компания	Кат. #	Типичные Сохранение данной	Типичные токи выброса
GABA	500 мМ	3.5-4.0	дН 2 O	Сигма	-2129	-15 НА	+5 До +100 нА нА
Глицин	100 мМ	3.5-4.0	дН 2 O	Сигма	G-7126	-15 НА	+5 До +100 нА нА
Бикукуллин Methiodide	10 мМ	3,0	0,165 М NaCl в дН 2 O	Сигма	B-6889	-15 НА	+5 До +60 нА нА
Strychnine гидрохлорид	10 мМ	3,0	0,165 М NaCl в дН 2 O	Сигма	S-8753	-15 НА	+5 До +80 нА нА
L-глутаминовой кислоты	500 мМ	8,0	дН 2 O	Сигма	G-1251	+30 НА	-10 До -150 нА нА
L-аспарагиновой кислоты	500 мМ	8,0	дН 2 O	Сигма	A-8949	+30 НА	-10 До -150 нА нА
Каиновой кислоты	1 мМ	9,0	дН 2 O	Сигма	K-0250	+30 НА	-10nA до -100 нА

Таблица 1. Часто используемых препаратов, с рН для растворения и концентрации. В таблице приведены наиболее часто используемые синаптических агонистов и антагонистов использоваться с ионофорез. РН среды перечисленных счетов за необходимость поляризации т Hese агентов, и предложил концентрация приходится на различия в эффективности между различными препаратами.

Рисунок 1. Три multibarrel пипетки с различными длинами чаевых. Кончике этого 5-бочка электрод был вытянут слишком длинные и тонкие. Обратите внимание, что кончик изгибается и очень мягкий. Этот тип наконечника очень трудно пробиться на нужный диаметр. B: кончик электрода это слишком короткий, и короткими. Когда продвинулся в более глубокие области мозга, этот электрод будет вызывать ненужные повреждения головного мозга в связи с тем, что электрод становится относительно толстых всего в несколько миллиметров после чаевых. C: пример электрода с правильно вытащил чаевых. Будучи длинный и тонкий, кончик все еще твердой и может быть нарушена легко желаемый диаметр кончика.

рисунке 2 "SRC =" / files/ftp_upload/4358/4358fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Рисунок электродный узел манипулятора. Манипулятора сборке используется вместе с микроскопом, чтобы собрать контрейлерные электродов. Поля, отмеченные серым цветом, коммерчески доступных продуктов и приведены в таблице 2. Поля, отмеченные синим были пользовательские обрабатываемых на машине нашем магазине учреждения. Они 1) 1/4 дюймовые стальные пластины размером 43x26 см с отверстиями для Newport этапе 423 пробурена в нее в соответствии с отверстиями предоставляемых Newport, 2) наклон стадии, что позволяет наклона сборки под произвольными углами, 3) соединитель, который монтируется держатель электрода к началу поступательного этапе.

Рисунок 3. Фотография образца контрейлерные электрода. Готовая 5-электрод баррель собрались вместе с одним стволом записи эль-ectrode. Обратите внимание, длинный вал около 7 мм позволяет глубоко записи мозг.

Рисунок 4. Титрование выброс тока. График показывает уровень интенсивности функции записаны от одного нейрона слухового а уши животного были стимулированы тонов различной интенсивности. Громкие звуки как правило, вызывают более высокий уровень стрельбы. До применения препарата, уровень интенсивности функции нейронов показало низкий всплеск ставок (черная кривая). Постепенно большие токи выброса их все более и более глицин рецепторов на нейрон, в результате чего постепенно более высокие темпы стрельбы. Оптимальным выброс тока в этом нейроне было 45-60 нА. С этим выброс тока, полной закупорки всех нейронов рецепторов глицина была достигнута. После завершения экспериментального протокола, ионофорез было прекращено, и нейронов было разрешеновосстановить. Полное выздоровление было достигнуто, когда скорость восстановления интенсивности функция соответствует начальной предварительной наркотиков восстановление функции. Воспроизводится с разрешения Американского физиологического общества, от Клуг и др., 1995.

Обсуждение

Мы опишем метод, который позволяет для манипуляций микросхемы одного нейрона в естественных условиях, и в то же время позволяя для записи ответов нейронов в ходе экспериментальных манипуляций. Нейронных цепей манипулировать через iontophoretical применения синаптических агонистов и антагонистов. Основным преимуществом ионофорез избыточное давление выброса в том, что ионофорез не требует физического перемещения жидкости из электрода в нервной ткани, и, следовательно, нет никакой озабоченности вызывают повреждение тканей через приложенного давления или объема жидкости. Основным недостатком этого метода является отсутствие информации об абсолютной концентрации препарата в ткани, и объем ткани влияет. Однако, поскольку количество фармакологических средств выбрасывается с ионофорез намного меньше и гораздо точнее, чем с управляемым давлением выброса, восстановление после применения препарата, как правило, гораздо быстрее,D гораздо более полным. Microiontophoresis была успешно использована в ряде нейронных систем, сенсорных и других, и применяется наиболее успешно в областях мозга, практически без внутренней обработки. Причина в том, что некоторые из выброшенных фармакологического агента может диффундировать из веб-приложение в соседний нейрон, а также манипулировать ответ свойств соседних нейронов.

Отдельные производства одно-и многолетних электродов ствола позволяет комбинация электродов с произвольными и не связаны свойства. Тяговая электрода баррелей вместе и, используя некоторые записи, а некоторые для ионофореза целей будет производить электродом советы с очень похожими свойствами, такими, что электроды советов будет либо слишком большим для одной записи ячейки, или слишком малы для применения препарата. Кроме того, наличие одного наконечника ствола выходит за рамки советы multibarrel электрода примерно на 20 микрометров значительно снижает шум в записях,D исключает возможной роли текущего эффект от сохранения или выброс тока на стрельбу нейрона ^3.

Контрейлерные multibarrel электродов впервые были описана более 30 лет назад и ^4-6 были использованы весьма успешно препарировать нейронных цепей ^{7-18 19-29.} Таким образом, метод сам по себе не является новым или уникальным. Тем не менее, конкретные детали подготовки электродов и использования были изменены на протяжении многих лет, и набор инструкций, описанных здесь оказалась особенно легко и успешно, и не было опубликовано подробно в другом месте в литературе. В частности, изгиб одним концом электрода ствола позволяет окончательного кончик контрейлерные электрод, относительно тонкий (рис. 3) и, таким образом, позволяет записей с глубоким ядер с минимальными повреждениями мозга, выступающие из одного ствола Электрод над несколькими баррель электрода удаляет практически во всех валютахт эффекты, которые часто приводят в качестве недостаток техники ^3. Новые подробности представлены здесь, такие как имеющий кончик электрода направлен вверх во время процесса склеивания и отдыха одного ствола в паз multibarrel электрод позволит обеспечить высокий уровень успеха при производстве контрейлерные электродов. Этот метод является относительно легким и как правило, может быть освоена новичка в течение нескольких дней.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название	Производитель	Комментировать	Кат. #
Бунзеновская горелка		Доступна с: VWR	17928-027
Двухкомпонентный стоматологического цемента: "Холодная лечения" Стоматологический материал	Co-орально-стоматологическая ITE Mfg. Co	Доступна с: AM Systems, Inc	525000
Двухкомпонентный стоматологического цемента: Протез материала сшивания жидкого соединения	Co-орально-стоматологическая ITE Mfg. Co	Доступна с: AM Systems, Inc	525000
Жидкий клей	Henkel	Доступна с: Loctite Super Glue	01-06849
Micro-Ионофорез Unэто: Neurophore BH-2	Harvard Apparatus	Доступна с: Harvard Apparatus	65-0200 и 65-0203
Изолированные серебряной проволоки	AM-Systems	Доступна с: AM-Systems	785500
Горизонтальная съемника	Zeitz DMZ-Universal Puller	Доступна с: AutoMate Научные	Не Доступно
Micro-манипулятор части: держатель электрода	WPI	Доступна с: WPI	M3301EH
Micro-манипулятор частей: линейной стадии	Newport 423 серии	Доступна с: Newport	423
Micro-манипулятор частей: вращение этапе	Newport RSP-2	Доступна с:Newport	RSP-2
Micro-манипулятор частей: г переводов	Newport 433 серии	Доступна с: Newport	433
Micro-манипулятор частей: уголок 90 ° собрать г и XY оси	Newport 360-90	Доступна с: Newport	360-90
Micro-манипулятор частей: х перевода / линейной стадии	Newport 423 серии	Доступна с: Newport	423
Micro-манипулятор частей: у переводом / линейной стадии	Ньюпорт-423	Доступна с: серии Newport	423
Микроскоп	Leitz Laborlux 11
Микроскоп: цель	Leitz Wetzlar 10x, NA 0.25		519760
Микроскоп: eypieces	Leitz Wetzlar, Periplan 10x/18		519748
Микроскоп: этап	Leitz Wetzlar		513544
Multibarrel капилляр	N / A	Доступна с: AM Systems, Inc	612000
Sinlge баррель капиллярные (GC 150F-10)	Harvard Apparatus	Доступна с: Harvard Apparatus	30-0057
Вертикальная съемника	Narishige модель ПЕ-2
		На заказ элементы Micro-манипулятор (отмечены свет бLUE на рисунке 1)
стальная пластина
наклона базы
крепления для держателя электрода
		Таблица 2. Производители и позиции всех оборудования и материалов, используемых в процедуре.