Насекомые<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Как мощная модель инфекции по расследованию бактериального патогенеза

Резюме

Устные и внутри haemocolic заражения личинок восковой моли больше Galleria mellonella Описано. Это насекомое может быть использована для изучения факторов вирулентности энтомопатогенных, а также млекопитающих патогенных бактерий. Разведение насекомых, способы заражения и примеры В естественных условиях Анализ описаны.

Аннотация

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of insects as infection models provides a valuable alternative. Compared to other non-vertebrate model hosts such as nematodes, insects have a relatively advanced system of antimicrobial defenses and are thus more likely to produce information relevant to the mammalian infection process. Like mammals, insects possess a complex innate immune system¹. Cells in the hemolymph are capable of phagocytosing or encapsulating microbial invaders, and humoral responses include the inducible production of lysozyme and small antibacterial peptides^2,3. In addition, analogies are found between the epithelial cells of insect larval midguts and intestinal cells of mammalian digestive systems. Finally, several basic components essential for the bacterial infection process such as cell adhesion, resistance to antimicrobial peptides, tissue degradation and adaptation to oxidative stress are likely to be important in both insects and mammals¹. Thus, insects are polyvalent tools for the identification and characterization of microbial virulence factors involved in mammalian infections.

Larvae of the greater wax moth Galleria mellonella have been shown to provide a useful insight into the pathogenesis of a wide range of microbial infections including mammalian fungal (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) and bacterial pathogens, such as Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes or Enterococcus faecalis^4-7. Regardless of the bacterial species, results obtained with Galleria larvae infected by direct injection through the cuticle consistently correlate with those of similar mammalian studies: bacterial strains that are attenuated in mammalian models demonstrate lower virulence in Galleria, and strains causing severe human infections are also highly virulent in the Galleria model^8-11. Oral infection of Galleria is much less used and additional compounds, like specific toxins, are needed to reach mortality.

G. mellonella larvae present several technical advantages: they are relatively large (last instar larvae before pupation are about 2 cm long and weight 250 mg), thus enabling the injection of defined doses of bacteria; they can be reared at various temperatures (20 °C to 30 °C) and infection studies can be conducted between 15 °C to above 37 °C^12,13, allowing experiments that mimic a mammalian environment. In addition, insect rearing is easy and relatively cheap. Infection of the larvae allows monitoring bacterial virulence by several means, including calculation of LD₅₀¹⁴, measurement of bacterial survival^15,16 and examination of the infection process¹⁷. Here, we describe the rearing of the insects, covering all life stages of G. mellonella. We provide a detailed protocol of infection by two routes of inoculation: oral and intra haemocoelic. The bacterial model used in this protocol is Bacillus cereus, a Gram positive pathogen implicated in gastrointestinal as well as in other severe local or systemic opportunistic infections^18,19.

протокол

1. Разведение насекомых

Весь цикл от яйца до личинки последнего возраста длится около 5 недель при температуре 25 ° C. Один или 2 дополнительных недель, необходимых для получения взрослых бабочек.

1. Разместите по меньшей мере 100 куколок или вновь объединились для взрослых G. mellonella бабочек в 5-литровых сетчатые клетки. Мужской бабочек измерения от 10 до 15 мм. Взрослый самец моли является бежевый с легким светлые и темные отметины. Женский мера бабочек около 20 мм. Самки темнее, чем у мужчин с коричневый / серый цвет.
2. Приостановить две пачки из четырех слоев бумаги в клетку для откладки яиц. Через 2 дня, взрослая самка откладывает яйца на грани между бумагами.
3. Два раза в неделю, поместите яйцо бумаги пакеты в новой пластиковой коробки воспитания с сетками для циркуляции воздуха, содержащие пыльцу и пчелиный воск. Яиц вылупляются примерно в 3 дня и мелкие личинки начинают развиваться, питаясь воском и пыльцой. Кроме того, личинки могут быть размещены на искусственной диете consistinг смеси из 500 г жидкого меда, 400 г глицерина, 100 г сушеных пивных дрожжей, 250 г пшеничной муки, 200 г сухого обезжиренного молока и 400 г поленты. Для обеспечения соответствующего соотношения продуктов на личинку, регулярно отделить личинок в новых коробках и пополнения пищи каждые два дня.
4. Личинки выращиваются в течение шести стадий личинки стадиона. Каждый стадион характеризуется проскальзывания головной капсулы личинок. Когда личинки достигают последней стадии перед окукливания, они прекращают кормление и начать строить света шелковый кокон.
5. В их защитные коконы, личинки будут отдыхать и превращаются в куколок. Воск черви остаются в стадии куколки в течение одной-двух недель выйти во взрослой моли. Взрослые моли не пить, ни есть. Спаривание происходит и жизненный цикл воска червей начинается снова.
6. Для стандартизации патологии анализа, принимают личинок в течение последних личиночной стадии. На этом этапе они перестают питаться, двигаться к крышке коробки воспитания и начать производить шелк. Это сTage длится около 5 дней.

2. Насекомое выбор для инфекции

1. Выбор последнего возраста личинок, которые в 2-3 см в длину и 180-250 мг в весе, до 24 часов инфекций и положить их в пустую коробку голодать им.
2. Удалить зарождающейся шелковый кокон вокруг личинок.

3. Бактериального препарата

1. Подготовка Bacillus бактериальной суспензии для получения конечной концентрации в диапазоне от 10 ⁴ колониеобразующих единиц (КОЕ) / мл до 10 ⁸ КОЕ / мл для инъекций внутри haemocoelic и от 3x10 ⁶ КОЕ / мл до 1х10 ⁸ КОЕ / мл для приема внутрь (КОЕ получить LD ₅₀ в зависимости от вида бактерий). В нашем случае, B. сегеиз выращивают в Лурия-Бертани бульон (LB, 10 г / л триптон, 5 г / л дрожжевого экстракта, 10 г / л NaCl) при 37 ° С при перемешивании до вступления в стационарную фазу, соответствующий изгиб роста кривую. Измерьте наружный диаметр 600 нм (между 1 и 2 B. Cereus) и использовать его для оценки концентрации бактерий, используя ранее сделанные кривой титрования. Урожай бактерий путем центрифугирования при 5000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре и ресуспендируют в фосфатным буферным раствором (PBS: 1M KH ₂ PO _4, 1M К ₂ НРО _4, 5 М NaCl, рН 7,2). Каждая личинка будет получать 10 мкл бактериальной суспензии в нужной концентрации.
2. Кроме того, суспензии спор может быть подготовлен к инфекции. Получить спор путем культивирования бактерий в среде споруляции HCT (5 г / л триптон, 2 г / л гидролизата казеина, 12,5 мМ К ₂ НРО _4, 12,5 мМ MgSO _4, 0,05 мМ MnSO _4, 1,2 ммоль ZnSO _4, 1,2 ммоль Fe ² (SO ₄₎ ^3, 0,5% H ₂ SO _4, 25 мМ CaCl ₂₎ ²⁰ при 30 ° С в течение 3 дней. Урожай спор путем центрифугирования (10.000 XG, 15 мин), и мыть два раза в стерильной дистиллированной воде. Ресуспендируют спор PELПусть в стерильной дистиллированной воды и тепла в течение 15 мин при 78 ° C, чтобы удалить остатки вегетативных бактерий. Нумеровать подвески при посеве серийных разведений на пластинах LB агар. Каждая личинка будет получать 10 мкл суспензии спор в нужной концентрации.

4. Cry токсинного подготовка

1. Подготовка Cry1C токсинов из B. Thuringiensis штамм 407 трансформировали плазмидой pHTF31C ²¹ несущего ген, кодирующий Cry1C. Культура напряжение в 100 средних HCT мл при 30 ° C в течение 72 ч с антибиотиками (эритромицин 10мг/мл) для обеспечения полного спорообразования, токсинов кристалла и освобождение в супернатант культуры.
2. Очисти кристаллы из супернатанта на 72% -79% градиенте сахарозы. Сначала добавьте 17 мл 79% сахарозы в 40 мл трубки. Осторожно слоя 17 мл 72% сахарозы в верхней части 79% сахарозы. Наконец, слой 5-6 мл концентрированного 10X спорулированных культуры и закрыть трубу. Центрифуга трубку в течение 14 часов при 20,000 мкг, 4 ° C, чтобы отделить кристаллы из спор. Сбор кристаллов на градиент интерфейс. Ресуспендируют кристалла гранул в 25 мл холодной стерильной воды, чтобы вымыть его. Центрифуга при 8000 х г в течение 20 мин. Этот шаг повторяется три раза, чтобы удалить все сахарозы придерживаться кристаллов. Ресуспендируют кристаллов в 5 мл стерильной воды и наблюдать под микроскопом, чтобы оценить чистоту.
3. Оценка концентрации токсина белка классический Bradford пятна на кристалле решение presolubilized в 50 мМ NaOH. Токсин кристаллы могут храниться при температуре от -20 ° C до использования.

5. Инжектор подготовка

1. Для контроля точный объем инъекции, использование автоматизированных шприцевой насос (например, KD Научно KDS 100) с настройкой скорости в 1 мкл / сек (рис. 1А).
2. Заполнить 1 мл шприца для подкожных инъекций 300 мл воды или бактериального раствора (1 шприц в состоянии) для заражения 20-25 личинок. Удалить пузырьки тщательно таpping шприца, затем приложите 0,45 х 12 мм иглой шприца.
3. Поместите шприц в инжектор.
4. Выполнять пустой инъекции 10 мкл в пустой трубе для контроля вводили объеме.

6. Насекомое Intrahaemocoelic инъекций

1. Поместите насекомых вручную, между большим и указательным пальцами. Затем вставьте иглу зафиксирован в инжектор в личинку кожи (кутикулы) (рис. 1С).
2. Держите насекомого на месте во время инъекции 10 мкл бактериальной решение (спор или вегетативных бактерий).
3. Осторожно удалите насекомое от иглы.
4. Поместите инфицированных насекомых в небольшой чашке Петри (5 см в диаметре), 5 личинок на блюдо.
5. Infect по меньшей мере 20 личинок на каждом экспериментальном состоянии.
6. Поместите блюд при 37 ° C в инкубаторе в течение 48 часов.

7. Насекомое кормления Force (проглатывании)

1. В 2-х трубной мл Eppendorf, смешать 0,2 мкг / м иU; л Cry1C токсин либо спор или вегетативных клеточной суспензии для получения конечной концентрации в диапазоне от 3х10 ⁴ до 1х10 ⁷ за 10 мкл.
2. Заполнить 1 мл шприц с 30G, 25 мм, иглы для подкожных инъекций по 300 мкл бактериального токсина-Cry1C решение для заражения 20-25 личинок. Удалить пузырьки из шприца.
3. Поместите насекомых вручную, так что ее рот входит игла фиксируется в инжектор (рис. 1D), и насильно кормить его с 10 мкл бактериальной решения с использованием автоматизированной шприцевой насос.
4. Infect по меньшей мере 20 личинок на каждом экспериментальном состоянии.
5. Поместите инфицированных насекомых в небольшом 5 см чашки Петри (5 личинок на блюдо). Поместите блюд при 37 ° C в инкубаторе в течение 48 часов.

8. Смертность Запись насекомых

1. После насильственного кормления или инъекции экспериментов, держать личинок в чашку Петри без пищи при температуре 25 ° C или 37 ° C. Проверьте личиночной движенияrtality регулярно в течение 48 часов периода. Мертвые личинки являются инертными и обычно становятся черными (рис. 1б).
2. Смертность данные могут быть проанализированы с помощью лог-пробит программы ^14. Эта программа проверяет линейность кривых доза смертности и дает летальные дозы (LD _50). Кроме того, другие программы, такие как Prism (Graph Pad), анализ выживаемости и смертности, данные могут быть использованы.

Результаты

Внутри haemocoelic введения бактерий в G. mellonella была доказана очень полезны для идентификации многих факторов вирулентности дело с повреждением тканей и устойчивость к врожденной иммунной факторов несколько человеческих патогенов. Например, фигура 2А представляет насекомых ?...

Обсуждение

Использование насекомых и особенно в личиночной стадии, так как инфекция моделей для нескольких патогенов, становятся частыми. Модель выбора для некоторых аспектов Drosophila (Fly Model), используемая как взрослых, так и личиночные ^1,2 сцене. Чешуекрылых насекомых G. mellonella также бы...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
Воск и пыльцу	La Ruche Roanaise	303000	Любой производитель меда
Автоматизированный шприцевой насос	KD Научные	KDS 100
Шприц 1 мл	Terumo	BS 01T
Иглой 0,45 х 12 мм	Terumo	Н. Н. 2613R
Чашка Петри 5 см	VWR	89000-300
Иглой 30G, 25 мм подкожных	Burkard Mfg. ООО	PDE0005