РНК-след Анализ Transcriptomes в тромбин обращению и контролю человека легочной микрососудистой эндотелиальных клеток

Dilyara Cheranova; Margaret Gibson; Suman Chaudhary; Li Qin Zhang; Daniel P. Heruth; Dmitry N. Grigoryev; Shui Qing Ye

doi:10.3791/4393

АВТОРЫ

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Method Article

РНК-след Анализ Transcriptomes в тромбин обращению и контролю человека легочной микрососудистой эндотелиальных клеток

DOI:

10.3791/4393

⸱

February 13th, 2013

Dilyara Cheranova¹, Margaret Gibson¹, Suman Chaudhary¹, Li Qin Zhang¹, Daniel P. Heruth¹, Dmitry N. Grigoryev¹, Shui Qing Ye¹

¹Children's Mercy Hospital and Clinics, School of Medicine, University of Missouri-Kansas City

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Резюме

Этот протокол представляет собой полный и подробный порядок применения РНК-след, мощный следующего поколения секвенирования ДНК технологии, профиль transcriptomes в человеческой легочной микрососудистых эндотелиальных клеток с лечением или без тромбина. Этот протокол является обобщением различных клеток или тканей под влиянием различных реагентов или болезненных состояний.

Аннотация

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the cell is affected by external signals (e.g. drug treatment), or how cells differ between a healthy state and a diseased state. With the advent and continuous refinement of next-generation DNA sequencing technology, RNA-sequencing (RNA-seq) has become an increasingly popular method of transcriptome analysis to catalog all species of transcripts, to determine the transcriptional structure of all expressed genes and to quantify the changing expression levels of the total set of transcripts in a given cell, tissue or organism^1,2 . RNA-seq is gradually replacing DNA microarrays as a preferred method for transcriptome analysis because it has the advantages of profiling a complete transcriptome, providing a digital type datum (copy number of any transcript) and not relying on any known genomic sequence³.

Here, we present a complete and detailed protocol to apply RNA-seq to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is based on our recent published study entitled "RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin,"⁴ in which we successfully performed the first complete transcriptome analysis of human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin using RNA-seq. It yielded unprecedented resources for further experimentation to gain insights into molecular mechanisms underlying thrombin-mediated endothelial dysfunction in the pathogenesis of inflammatory conditions, cancer, diabetes, and coronary heart disease, and provides potential new leads for therapeutic targets to those diseases.

The descriptive text of this protocol is divided into four parts. The first part describes the treatment of human pulmonary microvascular endothelial cells with thrombin and RNA isolation, quality analysis and quantification. The second part describes library construction and sequencing. The third part describes the data analysis. The fourth part describes an RT-PCR validation assay. Representative results of several key steps are displayed. Useful tips or precautions to boost success in key steps are provided in the Discussion section. Although this protocol uses human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin, it can be generalized to profile transcriptomes in both mammalian and non-mammalian cells and in tissues treated with different stimuli or inhibitors, or to compare transcriptomes in cells or tissues between a healthy state and a disease state.

протокол

Блок-схема изложением этот протокол отображается на рисунке 1.

1. Обработка клеток тромбина, РНК изоляции, оценке качества и количественной оценки РНК

Культура легких микрососудистой эндотелиальных клеток (HMVEC-LBL) до 90-100% слияния в 6-луночные планшеты в EGM-2 среды с 5% FBS, факторы роста и антибиотиков (Lonza, кошки # CC-3202).
Изменение средств массовой информации к голоду СМИ (0% FBS) 30 мин до начала лечения с тромбином.
Относитесь к клеткам с 0,05 ЕД / мл тромбина или оставить необработанными в качестве контроля в течение 6 часов при температуре 37 ° C и 5% CO _2.
Изолировать общей РНК из обработанных и контрольных клеток с использованием Ambion мир Vana комплекта в соответствии с инструкциями производителя.
Оценить качество РНК эукариот Experion чип StdSense РНК в соответствии со стандартным протоколом на Experion Автоматизированная станция электрофореза (= "_blank"> Www.bio-rad.com).
Количественная РНК с использованием стандартного спектрофотометрического метода.

2. Строительство библиотеки и последовательности

Используйте 1 мкг высокого качества общей РНК в образце исходного материала.
Чтобы построить библиотеку, выполните стандартную процедуру от Illumina (протокол № 15008136 Rev. A). В этом протоколе двух раундов поли (А), содержащий выборы мРНК выполняется для удаления рРНК, чтобы свести к минимуму последовательности рРНК.
Оценить качество библиотек с использованием ДНК-чипов Experion 1K в соответствии со стандартом протокола о электрофореза Experion Автоматизированная станция ( www.bio-rad.com ).
Количественная библиотеки с помощью КПЦР: Используйте библиотеку, которая ранее была последовательной в качестве стандартной кривой и праймеров, специфичных для лигированную адаптеров. Использование диапазона разведений неизвестные библиотеки (1:100, т.е., 1:500 и 1:1000). Запустите КПЦР АККОrding к протоколу SyberGreen ММ и расчета исходной концентрации запасов каждой библиотеке.
Развести библиотечных фондов до 10 нм и хранят при температуре -20 ° C до готовности кластера потоке клеток.
Когда все будет готово к кластеру проточной ячейки, растопить CBOT пластины реагента на водяной бане. CBOT является Illumina инструмент, используемый для упорядочения процесса генерации кластеров.
Вымойте CBOT инструмента.
Денатурации библиотеках: Объединить 13 мкл 1x TE и 6 мкл 10 мкМ библиотеки и, на стороне трубки, добавить 1 мкл 1 N NaOH (при условии, Illumina). Vortex, спин вниз, инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин и поместить денатурированный библиотеки на льду.
Развести библиотеках: Развести денатурированный библиотек с предварительно охлажденным гибридизации буфер (HT1, предусмотренных Illumina), объединяя 996 мкл HT1 и 4 мкл денатурированный библиотека для конечной концентрации 12 вечера. Поместите денатурированный и разводненной библиотеки на льду.
Обратить каждого ряда труб пластины CBOT,обеспечение того, чтобы все реагенты оттаивают. Спином вниз пластину, снять / прокол фольги уплотнения и загрузить на CBOT.
Алиготе 120 мкл разбавленного, денатурированный библиотеки полосу трубки, с номерами 1-8. Добавить 1,2 мкл разведенного, денатурированный управления PhiX библиотеке (от Illumina) в каждую пробирку как шип-контроль. Vortex и спином вниз трубы и загружать их на CBOT в правильной ориентации (труба № 1 справа).
Загрузите ячейку потока и многообразия на CBOT.
Выполните проверку расхода и начать кластеризации перспективе.
После запуска завершена, проверьте реагента Доставка по всей полосы. Обратите внимание на любые отклонения от нормы. Либо начать последовательность выполнения сразу или хранить проточной ячейки в предоставленной трубки при 4 ° C.
Оттепель последовательности через синтез (SBS, Illumina) реагентов.
Загрузка реагентов в соответствующие места на реагентов лотков, стараясь не прикасаться к другим реагентам после прикосновения к расщеплению смеси.
Использование неп-последовательности потока ячейки (т.е. тот, который был секвенирован ранее), премьер-линии реагента в два раза.
Тщательно очистите последовательности проточной ячейки с 70% этанола и Kimwipes, а затем 70% этанола и линзы бумаги. Осмотрите проточной ячейки для любой полосы. Повторно очистить его в случае необходимости.
Загрузите проточной ячейки на секвенсор и выполнять потока убедитесь, что уплотнение между многообразия и проточной ячейки плотно.
Начало последовательности запуска.
Оценка показателей качества (например, кластер плотность кластеров проходящего фильтр, Q30, интенсивность) по мере их появления во время бега.
Мониторинг интенсивности по всему перспективе.
После 101 циклов завершен, выполнить поворот химии для завершения второй следующего содержания: Оттепель парных конце реагентов и второго буфера регистрации чтения (ICB, компоненты SBS реагентов, Illumina) и загружать реагенты.
Продолжите последовательность выполнения, оценка ^2-й читать интенсивности, Q30й другие показатели качества выполнения прогрессирует.

3. Анализ данных

Используйте последние версии CASAVA (Illumina, в настоящее время 1.8.2), чтобы преобразовать базу вызова файлов (. BCL) файлы. Fastq файлов, установка fastq-кластера счетом 0, чтобы создание единого файла fastq для каждого образца . Распакуйте fastq файлы для последующего анализа.
Выполните парный конце трассы с использованием последних версий TopHat (1.4.1) ^5, который присоединяется РНК-след читает млекопитающего размером генома использованием сверхвысокой пропускной короткие выравниватель для чтения (Bowtie, 0.12.7) ⁶ и SAMtools (0,1. 17) ^7. SAMtools реализует различные утилиты для пост-обработки рядов в формате SAM. Ссылка человека транскриптом могут быть скачаны с iGenomes ( www.illumina.com ). В беге TopHat, мы использовали все стандартные параметры настройки, включая выбор типа библиотеки, как FR-unstranded (по умолчанию).
НамING программы CuffDiff, часть запонки (1.3.0) ⁸ пакет программного обеспечения, сравнить тромбин-обработанных клеток с контролем клетки, чтобы отсеивать разному экспрессируются генов транскрипты в бывшем основана на человека транскриптом ссылки. Это сравнение определяет дифференциальное выражение известно стенограммы. Использование Microsoft Excel для визуализации результатов в виде таблицы. В беге запонки программы, мы использовали все настройки параметров по умолчанию. Те, ген стенограммы с FPKM <0,05 и р> 0,05 отфильтровываются.
Для обнаружения новых изоформ, запустить запонки без ссылки транскриптом. Сравните примеры файлов стенограмму, чтобы референсного генома использованием Cuffcompare и проверить дифференциальные выражения с Cuffdiff с использованием комбинированного файла стенограмме тромбина в качестве опорного генома для одного анализа и комбинированный контроль расшифровка файлов в качестве опорного генома для второго анализа. Использование Microsoft Excel для визуализации результатов в табличной форме. Опять же, тыс.электронной гена стенограммы с FPKM <0,05 и р> 0,05 отфильтровываются. После этого шага, следователи могут выбрать, чтобы загрузить список вновь зарегистрированных стенограммы на сайте УСК браузера генома ( http://genome.ucsc.edu/ ) для проверки их достоверности по ручного досмотра.
Представьте списки разному экспрессируются гены изобретательность анализа путей (IPA, www.ingenuity.com ) для характеристики гены и пути, пострадавших от лечения тромбина. На данном этапе следователи могут решить использовать пояс ( http://compbio.mit.edu/cummeRbund/ ), пакет R, который разработан, чтобы помочь и упростить задачи анализа запонки РНК-след выходных, чтобы помочь управлять, визуализировать и интегрировать все данные, полученные с помощью анализа Cuffdiff.

4. Проверка РНК-последующие результаты по Количественные в режиме реального времени-Polymerase цепной реакции (QRT-PCR)

Выполните полной изоляции РНК из управления и тромбин обработанных HMVEC-LBL клеток, РНК оценки качества и РНК количественного описано в шагах от 1,4 до 1,6.
Создание комплементарной ДНК от 1 мкг суммарной РНК каждого образца с индексом III Первый Strand Синтез системы Комплекты РТ, в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen, 18080-051).
Выполните QRT-PCR анализа Applied Biosystems VIIa 7 Real-Time PCR System использованием Taqman анализа по требованию предназначен олигонуклеотидов для выявления CUGBP, ELAV-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor связанных фактор 1 (TRAF1, Hs01090170_m1) и β-актин (ACTB, Hs99999903_m1). Каждый образец был шаблон эквивалентно 5 нг общей РНК. Измерьте количественного использования DDCT метод и нормализовать β-актина. Каждый тест проводился по крайней мере, три биологических повторностях.