Массовые цитометрии: Протокол для ежедневного настройка и запуск образцы клеток на Цитометр массовой CyTOF

Резюме

Шаги, необходимые для ежедневной настройки и оптимизации производительности цитометр массы CyTOF описаны. Комментарии по оптимальной подготовки проб и расхода обсуждается

Аннотация

В последние годы быстрый анализ отдельных клеток имеет обычно были выполнены при помощи проточной цитометрии и флуоресцентной-меченых антител. Тем не менее, вопрос о спектрального перекрытия флуорофора выбросы ограничивает количество одновременных зондов. В отличие от нового массового CyTOF цитометр от DVS наук пары жидкости одноклеточных внедрение системы ICP-MS. ^{1, а не} флуорофоры, хелатирующие полимеров, содержащих высоко обогащенный изотопами металлов связаны с антителами или других специфических зондов. ^2-5 В связи с чистотой металла и масса разрешение масса цитометр, нет "спектрального перекрытия" из соседних изотопов и, следовательно, нет необходимости в компенсации матриц. Кроме того, благодаря использованию лантаноидов металлов, не существует биологический фон и, следовательно, нет эквивалента автофлуоресценции. С массой окна охватывающих атомной массой 103-203, теоретически до 100 этикеток можно было различить одновременно. В настоящее время, Более 35 каналов доступны при использовании хелатирующих реагентов можно получить DVS наук, что позволяет беспрецедентный рассечение иммунологического профиля образцов. ^6-7

Недостатки массовой цитометрии включают строгие требования к отдельным изотоп металла на зонд (нет эквивалента вперед или боковой разброс), а также тот факт, что она является разрушительной техники (без возможности восстановления сортировка). Текущая конфигурация массы цитометр также имеет скорость ячеек передачи только ~ 25%, что требует более высокого входного числа клеток.

Оптимальная ежедневная производительность массы цитометр требует нескольких этапов. Основная цель оптимизации заключается в максимизации измерений интенсивности сигнала нужного металла изотопов (M) при минимизации образования оксидов (M +16), что приведет к снижению M интенсивности сигнала и мешать любым сигнал на M +16. Первый шаг, чтобы разогреть машину таким горячим, стабильный яCP плазма была создана. Во-вторых, настройки для текущего и макияж расхода газа должны быть оптимизированы на ежедневной основе. Во время отбора проб, максимальная скорость событие ячейки ограничен эффективности детектора и скорость обработки до 1000 клеток / сек. Однако, в зависимости от качества образца, медленнее, клетки события (300-500 клеток / секунду), как правило, желательно, чтобы лучше разрешение между клетками событий и, таким образом максимально нетронутым синглеты более дублетов и мусора. Наконец, адекватная очистка машины в конце рабочего дня помогает минимизировать фонового сигнала из-за свободного металла.

протокол

Все клеточные образцы для CyTOF должны быть зафиксированы и проницаемыми. Это дает большую вступления иридий-содержащих ДНК интеркалятора, а также предотвращает лизис клеток во время стирки MilliQ воды и ресуспендирования шаги непосредственно перед введения в массу цитометр.

1. Запуск массового Цитометр

1. Откройте CyTOF программного обеспечения. Выберите инструмент настройки. На вкладке Кейдж карты, перейдите в правом нижнем углу и нажмите Нагреватель "ON" кнопку. Включите нагреватель по крайней мере 15 минут до нужного времени, чтобы обеспечить достаточное время для мантии камеры спрей для достигать 200 ° C.
2. Замените белый Norm-Ject 3 мл шприца в шприцевой насос с новой шприц, заполненный водой MilliQ.
3. Очистка распылителя. Обратной промывки распылителя с помощью шприца и трубки тянуть 5% citranox 2-3 раза через оба порта меньшего жидкость введения и больше портов введения газа. Повторите обратной промывки с водой MilliQ тO удаления остаточных citranox.
4. Проверьте, чтобы убедиться, что индикаторы на передней панели CyTOF горят как показано на рисунке 1.

Рисунок 1. CyTOF индикаторов панели до ввода в эксплуатацию.

5. Открытие аргона вентиль баллона. Это должно привести к «Аргон» индикатор на передней включить.
6. Присоединить распылитель для макияжа газа на входе. Отвинтите макияж разъем газовую трубку и снимите черные резиновые уплотнительные кольца и белой пластиковой конической части. Обратите внимание на широкие "кулака" в порту газа введения стволовых распылителя. Установите разъем на порт введение газа. Поместите черную уплотнительным кольцом на конце газового порта, и заставить уплотнительное кольцо мимо широкой части порта стебля. Поместите белые конические пластмассовую деталь на вершине с узкого конца указал, и винт на макияж газовую трубку.
7. Подключите распылитель с жидкостью трубки введения. Осторожно вставить небольшую трубку в отверстие на конце распылителя. Там будет две остановки, похожие на чувствовать себя остановки на микропипетки. Во-первых, нажимайте, пока вы встречаетесь светостойкостью; конце небольшой трубки должны быть в конце прямого участка стекла. Во-вторых, нажмите труднее заставить конце прямого участка стекла дальнейшем в примерочную, и затяните резьбовое соединение, чтобы запечатать. Вставьте конец распылителя в белый открытие в отопительный мантии.
8. На вкладке RFG контроллера в окне настройки инструмента, нажмите кнопку "Пуск Плазма". Поскольку распылитель уже вставлен, нажмите кнопку "OK". Программа будет включать чиллер, начать подачу газа, и зажечь плазму. Детектор напряжения будет наращивать. Там будет всплывающее окно: "Плазменный последовательности запуска успешного завершения", когда закончите, нажмите кнопку "OK". Новые фары должны быть на на передней панели (Рис. 2 >).

Рисунок 2. Огни CyTOF панели зажигается после плазменной и пуско-наладочные успешно завершена.

9. Включение шприцевой насос. В правом верхнем углу, нажмите на зеленую кнопку "Играть", чтобы начать шприцевой насос и начать поступать жидкость через трубку и распыления из распылителя. Настройки по умолчанию шприца в течение 3 мл воды. Для того, чтобы образец для протекающего через образец цикла, шприцевой насос необходимо периодически изменилось, когда он выбегает из воды. В верхней части экрана есть счетчик указывает, сколько жидкость вытекала из шприца. Шприцевой насос остановится, когда этот счетчик достигает "3,000" или поршень доходит до конца шприца. При заправке шприца, вы должны нажать «стоп», а не синие "пауза", чтобы сбросить счетчик.

е "> 2. Ежедневная калибровка средств массовой Цитометр

1. Масса цитометр потребуется примерно 20 минут до достижения горячий, устойчивой плазмы перед калибровкой. Целью шаг настройки заключается в максимизации полезного сигнала из Tm169 или Tb159, сохраняя при этом "Gd155" (оксид; La139 + О16) сигнала менее 3% от большей величины. Нажмите кнопку приобретение Настройки, чтобы открыть Data Acquisition окно настроек. На вкладке Аналиты, нажмите на периодическую таблицу, чтобы открыть панель изотопа выбор. Выберите изотопов в настройке DVS наук Решение перечисленных в инструкции, затем нажмите кнопку "сохранить".
2. Нажмите изотопов на чтение кнопку, чтобы открыть Масса (ы) за чтение окна. Выберите "Импульсы Граф", и масштабирование оси у, введя новый номер и нажать "Enter".
3. Заполните зеленого 1 мл Норма-Ject шприц с настройкой решение. Поверните селектор образца порт "Load", вводят 450 мкл настройке решение, затем повернуть переключатель в положение «впрыснуть». На вкладке массовой калибровки данных Acquisit ионный окно настройки, нажмите кнопку "Выполнить", чтобы контролировать, какие массы текут мимо. В левой части окна находится меньшую массу, в то время как правая сторона выше массы. Примечание: там уже будет сигналов в TOF 9400-9800 регионе, в связи с изотопов ксенона в газовой атмосфере аргона (рис. 3). Подождите, пока изотопов настройка решения начинают появляться полосы, как на этом экране (рис. 4).

Рисунок 3. Массовая калибровки вкладке окна, показывающий фонового уровня для различных изотопов после промывочного раствора и промывка водой. Область вокруг TOF 9400-9800 соответствует изотопов ксенона в газовой аргон, и должна всегда присутствовать. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

4 "SRC =" / files/ftp_upload/4398/4398fig4.jpg "/>
Рисунок 4. Массовая калибровки вкладке окна, показывая вертикальные полосы для различных изотопов в решении настройка DVS. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

4. Вернуться к массе (ы) за чтение окна и нажмите зеленую кнопку "Играть" в верхнем левом углу. Каждый изотоп, выбранный в шаге 2.1, представлены различные цветные линии. По умолчанию ось х "Время", в сек. Контроль за уровнем различных изотопов, пока они не устойчивы.
5. Тюнинг тока. На вкладке Параметры в окне Data Acquisition настройки, выберите "Current" из выпадающего меню. Пусть начать = 0, отделка = 10, значение шага = 0,5, время установления = 200, и нажмите кнопку "Сохранить". Вернитесь на массовые (а) За окном Чтение и нажмите игры. На оси Х сейчас "Current". Обратите внимание, где сигналы изотопов пика (рис. 5), а г ecord. При установке каналов DAC вкладки в окне настроек прибора, прокрутите вниз до "Current" и введите новое значение. Нажмите кнопку «Установить фактическое значение тока", затем "сохранить".

Рисунок 5. Текущий профиль настройки.

6. Тюнинг макияж газа. Изменение выпадающих меню на "Макияж газа". Пусть начать = 0,55, на конец = 0,95, значение шага = 0,05, время установления = 200. Нажмите кнопку Сохранить. Вернуться на массовые (а) За окном Чтение и нажмите игры. На оси Х в настоящее время "Макияж газ" расхода. Запишите, где сигналы пика изотопов. Обратите внимание на быстрый рост "Gd155" сигнал ближе к концу (рис. 6). Вернуться на вкладку Настройка каналов DAC, прокрутите вниз до "Макияж газ", и введите новое значение. Нажмите кнопку «Установить фактическое значение тока", затем "сохранить".

igure 6 "SRC =" / files/ftp_upload/4398/4398fig6.jpg "/>
Рисунок 6. Макияж газа настройке профиля.

7. Запись отношение целевого изотопа против оксид. Сделать второй 450 мкл инъекции настройки решения. На вкладке Параметры выберите "Время" от раскрывающегося меню, позвольте начать = 0, конец = 10, значение шага = 1, время установления = 200. Нажмите кнопку "Сохранить". Хит "играть" в Mass (ы) за чтение окна. После того, как линии, стабилизировалась (рис. 7), используйте курсор для чтения значения в левой верхней коробки для Tm169 или Tb159 (высокое значение), а также "Gd155" значение (<3% от большей величины). Эти значения могут быть сохранены в файле настройки для использования в будущем.

Рисунок 7. Измерение настройки интенсивности сигнала после решения оптимизации текущих и макияж газа.

8. Очистка образцаPLE цикла. Inject 3 мл воды MilliQ через образец петлю, затем 500 мкл промывочного раствора DVS. Следить за ходом очистки, нажав кнопку "Выполнить" на вкладке калибровочной массы. Мыть пока интенсивность полосы (рис. 4) начинает уменьшаться, а затем следуйте по 3 мл MilliQ воды и монитора, пока до фонового уровня (рис. 3).

3. Запуск Образцы

1. Откройте Приобретение окна. Настройки по умолчанию: сделать анализ = On-The-Fly, сигнал для анализа = двойной, двойной калибровки Count = данные. Шумоподавление выбрано. Любой из них может быть изменен по желанию. Введите имя файла. Все файлы должны быть сохранены в :/ E / привод.
2. Установка приобретение задержек. Там будет небольшая задержка в регистрации клетку событий около 30 сек в связи с длиной трубопровода между петлей и распылитель. Таким образом, сумма «Приобретение задержки» и «Детектор йВозможность задержки "должна быть не менее 30 сек. задержки детектор стабильность должна быть не менее 20 сек.
3. Настройка сбора данных время. "Приобретение времени" количество секунд, вы хотите работать с образцом. Заполнение всего 450 мкл петля потребуется 600 секунд, чтобы закончить. Предполагается, что 50-100 сек быть добавлена ​​к концу время выполнения свести к минимуму образца переноса.
4. Ресуспендирование образца. Чтобы свести к минимуму накопление солей в машину, он предположил, что по крайней мере два моет в воде MilliQ быть сделано в конце ячейки окрашивание, а затем окончательное ресуспендирования в воде MilliQ. Объем воды MilliQ используется для ресуспендируют осадок клеток будет меняться в зависимости от количества ячеек, которые начали с и восстановления клеток после всей процедуры окрашивания. Хорошей отправной точкой является 10 ⁶ (стартовую) клеток / мл. После ресуспендирования, процеживают через ячейку сито, чтобы удалить агрегатов.
5. Начиная образца бежать. Введите новое имя файла для текущего образца. Переключение клапана образца цикла "нагрузки", инъекционные образца, вернуться к «впрыснуть», а затем нажмите "Run" в приобретении окна.
6. Регистрация ячейки событий. Клетки будут представлены в снимок окна, горизонтальные коллекций марок в каждой вертикальной изотопа / маркер канала (рис. 8). В то время как масса цитометр может зарегистрировать 1000 клеток / сек, лучшее разрешение между ячейкой события обычно получают на 300-500 клеток / сек. Это соответствует в среднем ~ 1 клетка / обновления экрана. Это может занять до 30 секунд, прежде чем счетчик клеток событие начинает подниматься. Это связано с "On-лету" обработку данных; нет информации клетка события теряются.

Рисунок 8. Приобретение окна во время работающий образец, показывающий горизонтальными рядами пятен, соответствующих элементов, связанных с тремя отдельными событиями клетки.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg "целевых =" _blank "> Щелкните здесь для просмотра больших фигура.

7. Качество клеточных событий. Обратите внимание на любом фоне полос в каждом канале изотопов, а также скорость ячеек события. Масса цитометр признает "ячейки событий", как некоторое увеличение сигнала над фоном, так что фоновый сигнал от свободного металла или несвязанного антитела могут изменить "ячейки событие" кол. Кроме того, работает клетки при слишком высокой концентрации может привести к увеличению числа дублетов событий. Фон может быть уменьшен путем дополнительной промывки или более ячейки разведения. Дублеты можно свести к минимуму большую клетку разбавления, за счет увеличения времени выполнения.
8. Отделочные приобретение выборки данных. При приобретении время была достигнута, сбор данных будет завершен. Там будет немного задержки перед всплывающем окне кнопку "ОК" появляется, и снова это связано с "On-The-Fly" обработки данных. Примеры приобретения также может быть остановлен Премаurely, нажав кнопку "Стоп". В этом случае все ячейки событий уже зарегистрировано будут учитываться и обрабатываться в выходные файлы.
9. Инъекции не менее 500 мкл MilliQ воды между каждого образца также помогает минимизировать перенос образца.

4. Очистка машины после использования

1. Промывочного раствора. После окончательной пробы запустить и образец петля промыть водой, вводят 450 мкл промывочного раствора в образец цикла. Следить за освобождение свободного металла в закладке Массовая Калибровка сбора данных и окно настройки как в шаге 2,8 (рис. 9). Когда сигнал без металла начинает уменьшаться, заподлицо с 3 мл воды MilliQ и контролировать до фонового уровня будут достигнуты.

Рисунок 9. Массовая калибровки вкладке окна, во время поста перспективе очистки промывочного раствора с DVS. Вертикальные полосы в TOF области 9800-11000 являются антитела-метки изотопов очищается из машины. Вертикальные полосы вокруг TOF 11500 соответствуют двум изотопам Ir интеркалятора. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

5. Выключение машины

1. В RFG вкладке контроллер в окне настройки инструмента, выберите "Остановить Плазма". Когда процедура завершится, будет всплывающее окно с запросом на удаление распылителя. Нажмите "OK". На вкладке Кейдж карты, выключить обогреватель. Закройте клапан на поставку аргона.
2. Удаление распылителя. Снимите распылитель с распылительной камере, осторожно потянув назад. Отвинтите трубку ввода образца, начиная с шага 1.6 и поместить в сторону. Отвинтите макияж газа введения соединения, чтобы ослабить немного, затем потяните распылитель выключен. Оставив установки привинчены снизит шансы лosing черные резиновые уплотнительные кольца и белой пластиковой конической части.
3. Очистка распылителя. Обратной промывки и порты распылитель с 5% citranox с помощью шприца и трубки, как и в шаге 1.3. Магазин, покрытые, в 5% citranox до следующего использования.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В соответствии с вышеизложенным протокол должен выполнить четыре вещи. Во-первых, позволяющие адекватно время прогрева для массового цитометр будет производить горячее, устойчивой плазмы, необходимые для оптимальной сигнала и минимальное образование оксида. Во-вторых, адекватной пр?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

За последние несколько десятилетий, флуоресценция проточной цитометрии была рабочая лошадка метод анализа отдельных клеток, как с точки зрения поверхностной экспрессии и функционального анализа. Тем не менее, вопросы спектрального перекрытия флуоресцентных красителей имеет ограни?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
CyTOF TM массы цитометр	DVS наук
Промывочный раствор	DVS наук	201071	0,05% фтористоводородной кислоты в воде
Настройка решения	DVS наук	201072	0,5 промилле La, Cs, Tb, Tm, Ir, следы азотной кислоты
Eu-содержащих гранул полистирола	DVS наук	201073	Содержит натуральные изобилие Eu изотопов; бисером поставляется примерно в 1 млн / мл
Multi-лантанидов содержащих (La / Pr / Tb / Tm / Lu) - гранул полистирола	DVS наук	Не имеющиеся в продаже	Содержит натуральные изобилие изотопов перечисленные лантанидов
Азотная кислота (концентрированная)	Fisher Scientific	A467-500	Optima следов металлов чистого ICP-MS классе
Полистирол с круглым дном трубки с фильтром клетки-Cap-5 мл	BD	352235	используется для фильтрации образцов клеток перед инъекцией
Норма-Ject tuberkulin шприц-1 мл	Henke Sass Wolf	4010-200V0	без силикона, латекса
Норма-Ject шприц-3 мл	Henke Sass Wolf	4010.000V0	без силикона, латекса
MilliQ воды			18 МОм чистую воду, не следует хранить в стеклянных или пластиковых бутылках, которые были вымыты с моющим средством (в связи с их высоким уровнем бария настоящее время).
Гражданинranox	Sigma-Aldrich	Z273236	кислоты моющим средством
Аргон газ	Praxair	AR 5.0UH-T	99,999% ультра-высокой чистоты