Количественные исследования локомоции свободно плавающих микроорганизмов с помощью лазерной дифракции

Резюме

Микроскопические организмы, как свободное плавание нематоде C. Элеганс, Жить и вести себя в сложной трехмерной среде. Мы сообщаем о новом подходе, который обеспечивает анализ C. Элеганс С помощью дифракционной картины. Этот подход заключается в отслеживании временной периодичности дифракционных картин генерируются путем направления лазерного света через кювету.

Аннотация

Почвы и водных микроскопических организмов жить и вести себя в сложной трехмерной среде. Большинство исследований поведения микроскопических организмов, напротив, были проведены с использованием микроскопа на основе подходов, которые ограничивают движение и поведение в узком, почти двумерного координационного поле. ¹ Мы представляем новый аналитический подход, который предоставляет в реальном времени анализ свободно плавающих C. Элеганс в кювете вне зависимости от микроскопа на основе оборудования. Этот подход заключается в отслеживании временной периодичности дифракционных картин генерируются путем направления лазерного света через кювету. Мы измеряем колебания частоты для свободно плавающих нематод.

Анализ дальнего поля дифракционной картины показывает подсказки о сигналов нематод. Дифракция это процесс изгиба света вокруг объекта. В этом случае дифракции света на организмы. Световые волны мешают и могут образовывать объявлениеiffraction шаблону. Дальнем поле, или Fraunhofer, дифракционной картины образуется, если экран-объект расстояния гораздо больше, чем дифрагирующих объектов. В этом случае дифракционной картины можно рассчитать (по образцу) с помощью преобразования Фурье ^2.

C. Элеганс являются свободно живущих почвенных нематод, которые проводят в трех измерениях. Они двигаются, как на твердой матрице, как почва или агар в синусоидальном двигательного картина называется ползать и в жидкости в другой, называемый бассейн. ³ роли, которую играет сенсорное информации, предоставленной mechanosensory, хемосенсорной, и thermosensory клеток, которые управляют пластиковых изменения в двигательных моделей и моделей коммутаторов только начинают предстоит выяснить. ⁴ мы опишем оптических подход к измерению нематоды передвижения в трех измерениях, которые не требуют микроскопа и позволит нам начать изучать сложности передвижения нематод в различных сотрудничествеnditions.

протокол

1. C. Элеганс Подготовка к анализу видео

1. Переместить 10-20 беременной взрослых нематод на свежий NGM агар-заполненные чашки Петри с помощью тонкой, плоской выбор платиновой проволоки. Чашки Петри заполнены NGM агара содержат небольшое круглое пятно Е. палочка (рост ограниченной деформации, OP50, дает лучшие результаты) для нематод, чтобы поесть. Разрешить нематоды откладывают яйца в течение 3-5 часов, а затем удалить взрослым, таким образом, создание малых, умственно-синхронизированной культуре 50-150 нематод. Разрешить нематод вырастет до ранней зрелости путем инкубации чашки Петри при 20 ° С в течение 4-5 дней. Эти культуры методы основаны на установленных процедур (Stiernagle 2006) ^5.
2. В день анализа видео, промойте пластину молодых взрослых нематод с 1 мл деионизированной, дистиллированной воды, таким образом, сбор 50-150 червей из синхронизированной культуре. Буферный раствор, как M9 или PBS также может быть использован. Используйте микроцентрифужных вращаться соORMs в нижней части трубки, или позволить им поселиться под действием силы тяжести в течение примерно 15 мин. Удалите большинство воду из трубы и заменить его на 1 мл деионизированной, дистиллированной воды, чтобы вымыть любые придерживаясь бактерии от нематод.
3. Передача нематод в воде или буфер для кварцевых кювет помощью микропипетки. Важно работать с малым числом, около 5-10 нематод в общей сложности за один раз или даже меньше так что нематоды в то время, вероятно, будет освещении лазером. Если количество нематод на культуру пластин слишком велика, разбавьте червей в воде или буфере, пока будет достигнута требуемая плотность. Кроме того, можно выбрать отдельные нематод в капле воды или буфера на свежем пластины агара, чтобы вымыть их и передавать отдельные червей в кювет. В нашем исследовании мы использовали 1 мм, 2 мм и 5 мм размеры кюветы для изучения влияния физических ограничений по плаванию поведения.

2. Оптические установки для видео анас

1. Выполнить установку, как показано на рисунке 1, используя 543 нм (зеленый) гелий-неоновый (He-Ne) лазера, два передних поверхности алюминиевого зеркала, держатель кювет, проекционный экран и высокоскоростной камерой (Casio HIGH SPEED EXILIM), способные съемок на ~ 240 кадров в секунду. Два зеркала, которые используются, чтобы направить лазерный луч через кювету. Различные размеры кюветы могут быть использованы в зависимости от характера исследования. В качестве примера, мы использовали кювет, которые являются толщиной 5 мм, чтобы показать эффекты пространственного ограничения на плавание частот. Лазерный луч должен отвечать требованиям передискретизации;. Т. е. организм должен препятствовать не более одной трети лазерного луча. Для C. Элеганс, лазерный луч должно быть около 2 мм в диаметре, когда он взаимодействует с нематодой. Лазерный луч не должно быть более 5 мм в диаметре с дифракционной картины будет трудно найти. Расстояние от дифрагирующих организма на экране должно быть гораздо больше, чемсамого организма.
2. Место парафильмом поверх кювет и инвертировать его смешать нематод в толще воды. Поместите кювету в держатель кювет так, что черви первоначально в верхней части кюветы. Использование зеркал, направить лазерный луч через центр кюветы. Потому что нематоды плотнее, чем вода, они будут медленно падают на дно кюветы, и в то же время плавание в толще воды.
3. На проекционном экране, цвет пятна, соответствующего передается лазерный луч черного для уменьшения рассеяния проходящего пучка соответствует проекционного экрана (рис. 2). Кроме положить отверстие в проекционный экран, чтобы прошедшего пучка проходит через экран. Устранение или уменьшение рассеяния от прошедшего пучка будет держать ПЗС-матрицы камеры от насыщения из-за прошедшего пучка.
4. Для захвата мера размер дифракционной картины, рисовать линииоколо 5 см на проекционном экране рядом с местом передается лазерным лучом, не вмешиваясь в дифрагированной изображение светом.
5. Начало записи с камеры в то время как комната горит так, что 5 см линия находится на том же кадры, как дифракционных картин. Отключите кнопку освещения. Запись дифракционных изображений на экране с камерой, как черви проходят через лазерный луч.

3. Подготовка видео данных

1. Установить видео программы анализа (Logger Pro: http://www.vernier.com/products/software/lp/ ) на компьютере. Импорт видео в видео программы анализа
2. Установить происхождение совпадают с переданными лазерного пятна. Установить масштаб, используя 5 см линии на проекционном экране.
3. Трек углового смещения дифракционных изображения, формируемого каждым нематод с помощью программного обеспечения видео-анализа (рис. 3)
4. Чтобы найти AngulaГ смещения, принимая агс (у / х), копирования и вставки данных в электронную таблицу (Excel) и добавить 180 градусов или π для всех отрицательных углов для получения непрерывного графика (Figure. 4).

4. Real Time Data Acquisition для мгновенного наблюдения планировки Частоты

1. Используя те же настройки, что и для анализа видео, поместить фотодиод (DET10A от Thorlabs) с небольшой площадью (~ 1 мм ²⁾ с центром в дифракционной картины прямо перед проекционным экраном.
2. Подключить Фотодиод с цифровой осциллограф (PicoScope сделаны Pico Technology), которая подключается к компьютеру через USB порт. Обратите внимание на обмолот узоры на экране компьютера.
3. Сохранить приобрели наборы данных в ASCII или текстовом формате.

5. Анализ данных

1. Импорт данных, полученных с помощью видео или фотодиод в программу анализа данных, способных установку сигналов с помощью хи-квадрат минимизация. В программе использованы здесь происхождения ( http://www.originlab.com/ ). Установить синусоидальной кривой, чтобы определить пробуксовку частоты (рис. 4 и 5).
2. Средняя частот бассейн из различных образцов и определения дисперсии. Для этого исследования были проанализированы данные статистически с использованием однофакторного дисперсионного анализа следует Bonferroni несколько тестов сравнения. Значение р <0,05 считали статистически значимыми.

6. Модель Дифракционные текстуры использованием Mathematica в качестве примера

Примечание: Дифрактограммы могут быть смоделированы с использованием различных вычислительных средств. Эта процедура будет отличаться для различных вычислительных средств, таких как MatLab, Excel, происхождения и т.д.

1. Создать образ: Возьмите образы нематоды на предметное стекло микроскопа использованием традиционного микроскопа.
2. Binarize изображения: Импорт 'Worm' червь Изображение яNto Mathematica, перетащив изображение в Mathematica. Преобразование изображения в черно-белое изображение (Binarize). Это может быть достигнуто с «Binarize" команды в Mathematica: BlackandWhiteImage = Binarize [Worm]. Изображение может рассматриваться как черно-белое изображение.
   Также можно использовать команду 'EdgeDetect ", чтобы создать BlackandWhiteImage: EdgeDetect [Worm, 6.0,0.035], где два заднем числа управляют грубость в результате краев.
3. Преобразование изображения в матрицу из нулей и единиц: Это может быть достигнуто с «ImageData" команды в Mathematica: Matrix = ImageData [BlackandWhiteImage].
4. Преобразование Фурье матрицы: Используйте команду "Фурье" в Mathematica для преобразования Фурье-матрицы с использованием указанных FourierParameters: FTransform = Фурье [Matrix, FourierParameters -> {0, -2}].
5. Площадь модуля матрицы для получения дифракционных матриц и улучшить контрастность изображения: Квадрат абсолютногозначение матрицы и просматривать результирующее изображение, которое является дифракционная картина соответствует исходному изображению. Кроме того, используйте 'Log' Функция масштабирования контрастность изображения: ImageContrast = изображения [Log [1 + (Abs [FTransform]) ^ 2] / 0,5].
6. Изменение размеров изображения для удобного просмотра: кадрирование центральной дифракционной картины и размеры по желанию: ImageResize [ImageContrast [у, 100], 500].
7. Сравнить моделируемой дифракционных картин с дифракционной картины, полученные от свободно плавающих червей. (Рис. 6)

Результаты

В качестве примера, мы изучили C. Элеганс в кварцевой кювете 1 см шириной, толщиной 5 мм и 4 см высотой кювет. Отбор проб одного червя с помощью видео анализ, средняя частота бассейн получены из анализа видео в 5 мм кювете составляет около 2,5 Гц (рис. 4). Кроме того, отбор проб одного червя использованием данных реального времени приобретения метод, мы получим бассейн частотой около 2,7 Гц (рис. 5), с помощью цифрового осциллографа (PicoScope). Эта процедура может быть повторена для многих червей. Детальное изучение свободно плавающих червей показал среднюю частоту плаванию 2,37 Гц в 5 мм кювете. ⁶ Как и ожидалось, бассейн частота выше, чем для ползающих червей (~ 0,8 Гц). ³ Использование этого метода дифракции, средние частоты плавания C. Элеганс, которая приурочена к предметное стекло микроскопа, было найдено в соответствии с ранее опубликованным значением 2 Гц. ^1,7

ve_content "> После процедур 3.), а затем 6.) позволяет моделировать плавания дифракционных картин при помощи червя изображений, полученных с помощью обычного микроскопа. моделируемой дифракционных картин используются для имитации плавать цикла C. Элеганс ( Рисунок 6). успешная модель состоит из физически возможным последовательное моделей плавания для бассейна частот. червя должна быть в той же форме в конце плавания цикла, как это было в начале плавания цикла.

Рисунок 1. Зеленые гелий-неоновый лазер был использован для создания динамической дифракционной картины с использованием живых C. Элеганс. Это дифракционной картине был снят при 240 кадрах в секунду.

Рисунок 2. Dra Крыло черная точка увеличивает поглощение проходящего пучка. Насыщение камеры за счет рассеянного света уменьшается, и дифракционной картины становится видимым.

Рисунок 3. Снимок экрана программного обеспечения для анализа видео (Logger Pro) с рисунком червь дифракции, который отслеживается. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 4. Video данных, соответствующих плавать цикл нематоды в 5 мм кювете. Кривая показывает, подходит плавание частоте ~ 2,5 Гц.

"/>
Рисунок 5. Данные в реальном времени соответствующие плавать цикл нематоды в 5 мм кювете. Кривая показывает, подходит плавание частоте ~ 2,7 Гц.

Рисунок 6. Верхняя строка представляет фактическое дифракционных картин и согласован с моделируемой дифракционных картин в нижнем ряду. Моделируемой дифракционных картин были получены с помощью червей на предметное стекло микроскопа (средний ряд).

Обсуждение

Мы разработали новый подход к реальном времени измерения движения и простые двигательного поведения в микроскопических организмов, таких как нематоды, которые не требуют использования микроскопов. ⁸ Данный методологический подход может также быть использована для изучения многочисленных микроскопических организмов, как простейшие. Этот метод ограничен только длиной волны используемого света. Организм не должна быть меньше, чем длина волны света. В дополнение к экономии и мобильность оборудования, необходимого, одним ключевым преимуществом такого подхода является возможность измерения поведения в реальном времени и в трех измерениях, без узких ограничений изображение самолета под микроскопом. Кроме того, можно с помощью этой техники для изучения влияния гравитационных сил или многих других условий на поведение, которое не может быть изучена с помощью микроскопа подходов. ⁹ Таким образом, мы можем добиться лучшего понимания микроорганизмов природного двигательного бэхаviors освободился от оков предметное стекло капли или специализированных камерах микрофлюидных (Park и др., 2008) ^10.

Отсутствие информации о фазе в дифракционной картины не позволяет прямого поиска изображения, соответствующие дифрагирующих объектов с дальнего поля дифракционной картины пропорциональна квадрату абсолютной величины преобразования Фурье. Поэтому мы расчета дифракционных картин от червя изображений, так что они могут быть сопоставлены с дифракционной картине свободно плавающих нематод (рис. 6).

Этот метод дал результаты, по-настоящему свободное плавание C. Элеганс и может быть применен к любой микроскопический вид, что маневры в оптически прозрачных средах, таких как вода или различных ионных растворов. Обычные микроскопы позволяют только исследования с фокусным глубины порядка микрометров. ¹¹ Это из-за ограниченногоГлубина резкости при фокусировке света:

где F-число N имеет обратную связь с кружка рассеяния (с), так что короткое фокусное расстояние связано с большими с. ^12,13 Хотя этот метод дифракции, безусловно, не является заменой для обычного микроскопа, она способна поставить количественные результаты быстро, так что вид может быть даже манипулировать в реальном времени при низкой стоимости. Дифракционной картины может быть получен с любого лазерной указкой. Дифракционной картины может быть снят при пониженном временное разрешение с помощью обычного цифрового фотоаппарата. В то время как пользователь может не иметь микроскопа или фотодиод легко доступны, ключевые части этого эксперимента, таких как измерение частоты обмолота и оценки дифракционной картины может быть завершена при очень низкой стоимости.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Имя	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
543 нм гелий-неоновый лазер	Melles Griot	LGX1	Любой лазер видимого диапазона с менее чем 5 мВт может быть использован.
2 Передняя алюминиевая поверхность зеркала	Thorlabs	PF10-03-F01
Высокоскоростная камера Exilim	Casio
Кварцевые кюветы	Клетки Starna	21/G/5
LoggerPro (Software)	Верньер		http://www.vernier.com/products/software/lp/
Mathematica 8	Вольфрам		http://www.wolfram.com/