Долгосрочные, Высокое разрешение конфокальной микроскопии Lapse время<em&gt; Arabidopsis семядолей</em&gt; Эпидермиса во время прорастания

Резюме

Мы описываем протокол, используя камеру слайды и средств массовой информации для иммобилизации завода семядоли для конфокальной микроскопии эпидермиса в течение нескольких дней развития, документирования устьичного дифференциации. Флуорофор-меченных белков можно проследить динамически выражения и внутриклеточной локализации, повышения понимания их возможной роли в процессе деления клеток и их тип дифференциации.

Аннотация

Изображений в динамике естественных клеточных поведение всей последовательности развития может стать мощной техникой для понимания механики ткани рисунка. Во время развития животных, ключевой клеточной пролиферации и структурирование события происходят очень быстро. Например, в Caenorhabditis Элеганс всех клеточных делений, необходимых для личиночной плана тела будут завершены в течение шести часов после оплодотворения, с семи митотических циклов ^1; шестнадцать или более митозов эмбриогенеза дрозофилы происходит менее чем за 24 часа ^2. В отличие от клеточных делений во время развития растения медленно, как правило, на порядок дня ^3,4,5. Это накладывает уникальный вызов и потребность в долгосрочных живого изображения для документирования динамического поведения деления и дифференцировки клеток событий во время завод органогенеза. Arabidopsis эпидермис является отличной системой модель для исследования сигнализации, судьбы клеток и развитие растений. В семядолей, эта ткань состоит из воздуха и воды, устойчивый тротуаров клетки вперемешку с равномерно распределенной устьиц, клапаны, которые открываются и закрываются, чтобы контролировать обмен газов и потери воды. Правильное расстояние между этими устьица имеет решающее значение для их функция, и их развитие следует последовательность асимметричное деление и дифференцировку клеток шаги для создания организованного эпидермиса (рис. 1).

Этот протокол позволяет наблюдать клеток и белков в эпидермисе в течение нескольких дней развития. Этот срок позволяет точной документации стволовых клеточных делений и дифференцировки клеток эпидермиса, в том числе устьиц и эпидермальных клеток тротуар. Флуоресцентные белки могут быть слиты с белками, представляющие интерес для оценки их динамики в процессе клеточного деления и дифференциации процессов. Эта техника позволяет нам понять, локализация нового белка, полярный ^6, во время распространения этапе устьичного-линия клеток в гоэлектронной Arabidopsis семядоли эпидермис, где он экспрессируется в клетках предшествующих событий асимметричным разделением и переходит к характерным области клетки коры незадолго до разделения происходит. Изображения могут быть зарегистрированы и упорядочить видео легко производятся с использованием программных средств для визуализации динамической локализации белков и клеточных типов, как они меняются с течением времени.

протокол

1. Семенной стерилизации

1. Подготовка семян стерилизации раствор: 33% бытового отбеливателя, 0,1% Triton X-100.
2. Место проведения семена желаемого флуоресцентные конструкции репортер (ы) и генотип (ы) в 1,7 мл трубки и применяют 1 мл стерилизации решение. Инкубируйте на nutator в течение 15 мин.
3. В стерильных капот, использование пипетки для удаления стерилизации раствор из трубки, оставляя семена позади. Промыть 1 мл стерильной воды. Повторите четыре раза.
4. Инкубировать при температуре 4 ° С в течение двух или более дней.

2. Подготовка палаты Слайд-Медиа

1. Смешайте 20 мл 0,5% раствора Bacto Агар (не чисто агарозы) в воде в 200 мл колбу, и микроволновую печь до полного растворения. Будьте осторожны при кипячении раствора.
2. Охладите раствор примерно до 60 ° C.
3. Сбор 1 мл агара раствор с пипетки и медленно распространяется на защитное стекло внутри слайда камеры (Lab-Tek II Chambered # 1.5 немецкой системы покровного стекла). Решение Wакие слишком горячей или применяется слишком быстро может расплавить клей или трещины стекла.
4. Сразу добавим второй мл агара решение. Агар СМИ должны теперь полностью покрывают нижней части слайда камеры. Это минимальные средства массовой информации достаточно, чтобы поддерживать развитие растений семядоли, которая содержит питательные вещества хранятся в течение четырех-пяти дней, сохраняя влагу и позволяет диффузии газов.
5. Прохладный слайд на настольном с камеры покрыты. Если колба покрыта плотно, решение может быть сохранен и нагревают для использования в будущем.

3. Семенной Dissection

1. Убрать трубы стерильных семян от 4 ° C хранения.
2. Поместите бумагой на сцене рассекает микроскопом и смочить водой. Отрегулируйте ткани, чтобы создать гладкую поверхность. Ткань используется для стабилизации семена для вскрытия.
3. Внесите 20-30 семян из трубы на ткани, соблюдая осторожность, чтобы разместить их в поле рассекает сферу зрения.
4. Использование резкое щипцы (Roboz, № 5 биологии наконечник), Осторожно удалите семена пальто из рассады внутри. И внешние и внутренние покровы должны быть удалены.
5. При визуализации семядолей, это выгодно для удаления гипокотиль и корешков. Семядоли содержат достаточно питательных веществ, чтобы развиваться в течение нескольких дней в соответствии с настоящим Протоколом. Если нетронутыми, гипокотиля будет выпрямить и удлинить резко, двигаясь семядоли из поля промежуток времени зрения. Используйте скальпель, чтобы разрезать семядоли бесплатно гипокотиля.
6. Держите расчлененный семядоли погружается в воду, в микропробирку или аналогичный.
7. Повторите 3.4-3.6 нужное число семядолей будет достигнута. 15-20 успешным вскрытия рекомендуется перед монтажом.

4. Монтаж Семядоли в палате слайдов

1. С помощью небольшой (18 мм ²⁾ покровного стекла, вырезать через агар средств массовой информации и снять весь слой вверх из стекла базе камеры слайда.
2. Внесите расчлененный семядоли с минимумом воды от проведениятрубка в камере слайд, под поднимаемым слой агара.
3. Осторожно опустите агара на семядоли. Если избыточная вода присутствует, замочите его прочь с тканью, стараясь не нарушать семядоли. Образцы не должны больше двигаться легко, когда крепление завершена.
4. Поместите крышку на слайде камеры и движение слайд столик микроскопа.

5. Длительная изображений

1. Установите перевернутую конфокальной микроскопии для получения изображения желаемого флуорофора (ы). LSM700 параметров, используемых: для GFP, возбуждение при 488 нм и сбор с полосовой фильтр на 440-530 нм; для RFP, возбуждение при 555 нм и сбор с полосовой фильтр на 570-610 нм.
2. Проверьте установлены образцы на наличие повреждений. Запрограммируйте мест нетронутыми, правильно установлен семядолей в микроскоп программного обеспечения. В дзен-2009: фокус на семядоли с 20-кратным цель и двигаться к цели центре камеры слайдов. При приобретении режим, изменить увеличить до 0,5 и размер кадра </ EM> до 48x48 пикселей. Выберите позиции флажок и сканирование обзор изображение ... кнопку под позиции, то увеличьте горизонтальный и вертикальный номера плитки до 30-35. Когда проверка будет завершена, нажмите кнопку позиций под размеры вкладки и место перекрестия на каждой семядоли, чтобы наблюдать.
3. Установить серии Z охватывает семядоли эпидермис все samples.In Zen 2009: Нажмите Z-Stack флажок. Выберите каждую позицию по позиции списка и нажмите кнопку Переместить. Сосредоточьтесь на верхней плоскости семядоли эпидермис и нажмите кнопку Set Первая кнопка под Z-Stack. Фокус в самое нижнее положение, при котором эпидермис полезно видимых и нажмите на кнопку Set последний. Нажмите кнопку рядом с оптимальной, который показывает лучшие Z-толщина среза, чтобы установить. Проверьте каждый семядолей, чтобы подтвердить, что эти параметры охватывают все образцы; г параметры не могут быть установлены для индивидуумыidual должностей в дзен-2009.
4. Установка временных рядов в нужное разрешение и длины. Интервалы 15-30 мин в течение трех дней являются эффективными для динамики белков в делении клеток эпидермиса. Этот интервал может быть изменен по мере необходимости. В дзен-2009: установите флажок временных рядов. Под временных рядов, установить циклы для количества изображений желаемого с помощью ползунка или введя в текстовое поле. Установить интервал до 30 и использовать выпадающее меню для выбора мин.
5. Начало xyzt несколько позиций сканирования. Обратите внимание, что число позиций должно быть ограничено по результатам проверки спецификаций, если общее время сканирования больше, чем требуемый интервал, моменты времени не будет правильным. Не более шести одновременных позиций возможно при визуализации GFP и RFP на 59 г ломтиков в 30-минутный интервал использования нашей системы. В дзен-2009: Изменение размера кадра в нужное разрешение и нажмите кнопку Пуск эксперимент.

6. Редактирование видео

1. С конфокальной файл данных, сделать максимальную интенсивность г-проекции каждый раз / позиция комбинации и экспорт в виде файлов изображений в формате без потерь, таких как TIFF. Имена файлов должны быть в одной серии в положение (например, POLAR-GFP_pos1_0001, POLAR-GFP_pos1_0002 и т.д., не POLAR-GFP_0001_pos1) для программного обеспечения, чтобы объединить их в фильме. В дзен-2009: использование копий: Подгруппа по вкладке Обработка разделить позиции в отдельные файлы, то максимальная интенсивность проекции. И, наконец, экспортировать как TIFF (Файл: экспорт, полный окна разрешение изображения - серия).
2. Используйте ФИДЖИ ^7,8 для выравнивания последовательных изображений, выполнив bUnwarpJ ^макро-9 (Плагины: Дата регистрации: bUnwarpJ). Измените режим регистрации на Mono. Все Advanced Options можно использовать значения по умолчанию. Для длинных последовательностей промежуток времени, загрузить и установить макрос "Аффинные + В соответствии Упругие 2D Регистрация изображения", который будет применяться bUnwarpJ к серии изображений автоматически, и у открытыхнаших данных с использованием файла: Импорт: последовательность изображений, чтобы использовать его. Снимите MOPS достопримечательностями добычи и перспективе.
3. Используйте Фиджи / ImageJ или Quicktime Pro, чтобы открыть последовательность соответствие изображения и сохранить в нужном формате видео (AVI является хорошим выбором).

Результаты

Набор информативных моментов времени собрано с помощью этого метода показана на рисунке 3. Клеточные мембраны помечены RFP (ч. РБ) и GFP сливается с POLAR белка под его родном промотора (POLAR :: POLAR-GFP) ⁶ В 30-минутной шкалой времени, мы видим, деление клеток, наряду с изменения...

Обсуждение

Это покадровой конфокальной методика позволяет продольных исследований флуоресцентно отмеченных экспрессии белка и локализации в отдельных клетках Arabidopsis эпидермиса семядолей, которые, в случае полярных и других динамично меняющейся белков имеет решающее значение для правиль?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
Bacto Агар	BD	214010
Один-камера слайд	Nunc (Thermo Scientific)	155360	Или две камеры (155379)
Лазерной сканирующей конфокальной микроскопии	Zeiss	LSM700	Zen 2009 программное обеспечение
20-кратный объектив	Zeiss	420650-9901	NA 0.8, Plan-Apochromat
Препаровальная лупа	Benz (национальных)	431TBL	Горит снизу
# 5 щипцы, биологии чаевые	Roboz хирургических инструментов	RS-4978	Очень тонкий советыявляются критическими