Селективный захват 5-hydroxymethylcytosine из геномной ДНК

Описывается два шага маркировки процесса с использованием β-glucosyltransferase (β-GT), чтобы передать азид-глюкозы до 5-HMC, а затем нажмите химия для передачи биотин компоновщика для легкой и плотности независимых обогащения. Это эффективный и конкретный маркировки метод позволяет обогащению 5-HMC с крайне низким фоном и высокой пропускной эпигеномном отображения с помощью следующего поколения секвенирования.

Аннотация

5-метилцитозин (5-MC) составляет ~ 2-8% от общего цитозина в геномной ДНК человека и влияет на широкий спектр биологических функций, включая экспрессию генов, поддержание целостности генома, родительского импринтинга, инактивации Х-хромосомы, регуляция развития, старения и рака ^1. В последнее время в присутствии окисленного 5-тС, 5-hydroxymethylcytosine (5-HMC), был обнаружен в клетках млекопитающих, в частности, в эмбриональных стволовых (ЭС) клеток и нервных клеток ^2-4. 5-HMC образуется при окислении 5-тС катализируемой ТЕТ семьи железа (II) / α-КГ-зависимых диоксигеназ ^{2, 3.} 5-HMC предлагается принять участие в поддержании эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) клетки, нормального кроветворения и злокачественных новообразований, а также развития зиготы ^{2, 5-10.} Чтобы лучше понять функции 5-HMC, надежный и простой последовательности системы имеет важное значение. Традиционная последовательность бисульфита не могут отличить 5-HMC из 5-тС ¹¹ 12.

Здесь мы опишем простой двухэтапной процедуры для селективного маркировки химической 5-HMC. На первом этапе маркировки, 5-HMC в геномной ДНК помечена с 6-азид-глюкозы, катализируемой β-GT, glucosyltransferase из бактериофага Т4, таким образом, что переводит 6-азид-глюкозы до 5-HMC из Изменения кофактора, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). На втором этапе, биотинилирование, линкер дисульфида биотин прикреплен к азид группу, нажав на кнопку химии. Оба шага весьма конкретные и эффективные, ведущие к полному маркировке независимо от обилия 5-HMC в геномных регионов и дает крайне низкий фон. После биотинилирования 5-HMC, 5-HMC-содержащих фрагменты ДНК затем выборочно захваченныеиспользованием стрептавидина бусы в плотности независимым образом. Полученный 5-HMC-обогащенного фрагменты ДНК могут быть использованы для последующего анализа, в том числе следующего поколения секвенирования.

Наш избирательный маркировки и захват протокол дает высокую чувствительность, применимы к любому источнику геномной ДНК с переменным / разнообразна 5-HMC содержания. Хотя основной целью этого протокола является его вниз по течению приложений (например,. Следующего поколения секвенирования, чтобы наметить 5-HMC распределение в геноме), она совместима с одной молекулой, в режиме реального времени SMRT (ДНК) последовательность, которая является способные доставлять одной базе резолюции последовательности 5-HMC.

протокол

1. Геномной ДНК фрагментации

Фрагмент геномной ДНК с использованием ультразвука до нужного размера диапазона подходит для генома последовательности платформы. (Мы обычно разрушать ультразвуком до ~ 300 б.п.). Убедитесь, распределение по размерам фрагментированной геномной ДНК на 1% агарозном геле (рис. 1).

2. Подготовка ДНК

Определение исходной ДНК суммы, основанные на обилие 5-HMC в геномной ДНК. С 5-HMC уровни значительно различаются в разных типах тканей, начиная количества ДНК зависит от 5-HMC уровней образцов. Пожалуйста, обратитесь к таблице 1 для примера.

3. β-GT катализируемой реакции (реакции глюкозы Transfer)

Смешать с помощью пипетки смесью, как указано в таблице 2 и инкубировать при 37 ° С водяной бане в течение 1 часа.
После инкубации, очистка реакции с QIAquick нуклеотидных Kit удаления, используя 10 мкг ДНК настолбца. Элюировать 30 мкл воды в колонке и объединить.

4. Биотинилирование реакции (Click Chemistry)

Добавить DBCO-SS-PEG3-биотин сопряженных рабочий раствор (1 мм) в Элюированную решение ДНК (с шагом 3) до конечной концентрации 150 мкМ (то есть, 5 мкл рабочего раствора в 30 мкл раствора ДНК).
Перемешать пипетированием и инкубируют при 37 ° C на водяной бане 2 часа.
Очистка реакции с QIAquick нуклеотидных Kit удаления. В идеале общий объем элюирования 100 мкл.
Количественная восстановленных ДНК сумму с помощью микролитр масштаба спектрофотометр (например,., NanoDrop).

5. Захват 5-HMC-содержащих ДНК

Вымойте 50 мкл Dynabeads MyOne Стрептавидин C1 3 раза с 1 мл 1X B & W буфера в соответствии с инструкцией завода-изготовителя. Отделить бусин с магнитным стенда.
Добавить равный объем 2X B & W буфер для восстановления биотинилированного DNA (100 мкл) в промытых бус.
Инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре с легким вращением на ротатор.
Отделить бусин с магнитным стенд и мыть гранул 3 раза с 1 мл 1X B & W буфера.
Элюируйте ДНК путем инкубации бисером в 100 мкл свежеприготовленного 50 мМ DTT в течение 2 часов при комнатной температуре с легким вращением на ротатор.
Отделить бусин с магнитным стенда. Аспирируйте элюента и нагрузка на Micro Bio-Spin 6 колонку в соответствии с инструкцией производство, чтобы удалить DTT. ДНК-мишени в решение сейчас.
Очищают Элюированную ДНК из предыдущего шага по Qiagen MinElute ПЦР-комплект для очистки и элюируются ДНК в 10 мкл буфера EB. Количественная ДНК с использованием Кубит Флуорометр, или NanoDrop, если их концентрация превышает 20 нг / ул. ДНК готова для последующей генома подготовки библиотеке последовательности.

6. Представитель Результаты

Если качество выводаF геномной ДНК является высокой, типичной дает восстановление после β-GT и биотинилирование реакции ~ 60-70%. Тем не менее, эффективность захвата существенно различаться с различными типами тканей в зависимости от 5-HMC уровней образцов. Как правило, эффективность захвата головного мозга геномной ДНК составляет ~ 4-9%, а в некоторых крайних случаях эффективность может достигать 12%. Для ЭС клеток, средняя эффективность улавливания составляет ~ 2-4%, в отличие от ~ 0,5% для нейронных стволовых клеток. Низкая эффективность видели до сих пор было для геномной ДНК из раковых клеток. Все ДНК, обогащенной готова к стандартным следующего поколения протоколов библиотеке подготовки. Кроме того, захваченных ДНК может быть также использован в качестве шаблона для ПЦР в реальном времени для обнаружения обогащения некоторых фрагментов по сравнению с входным ДНК, если соответствующие праймеры имеются.

figure-protocol-4014
Рисунок 1. Ультразвуком геномной ДНК человека фрагментов в1% агарозном геле. 10 мкг геномной ДНК, выделенной из клеток человека плюрипотентных в 120 мкл 1X TE буфера ультразвуком помощью ультразвука устройство (Covaris). После обработки ультразвуком, 2 мкл ДНК ультразвуком был загружен на 1% агарозном геле с использованием 100 п.н. ДНК маркеров для сравнения размеров фрагментов ДНК ультразвуком.

Компонент	Объем	Конечная концентрация
Воды	_ Мкл
10 X β-GT Реакционный буфер	2 мкл	1 X
До 10 мкг геномной ДНК	_ Мкл	До 500 нг / мкл
UDP-6-N _3-Glc (3 мМ)	0,67 мкл	100 мкМ
β-GT (40 мкм)	1 мкл	2 мкМ
Общий объем	20 мкл

I) Для ткани геномной ДНК (высокое 5-HMC содержимого> 0,1%)

Компонент	Объем	Конечная концентрация
Воды	_ Мкл
10 X β-GT Реакционный буфер	10 мкл	1 X
До 20 мкг геномной ДНК	_ Мкл	До 500 нг / мкл
UDP-6-N3-Glc (3 мМ)	1,33 мкл	100 мкМ
β-GT (40 мкм)	2 мкл	2 мкМ
Общий объем	40 мкл

II) Для стволовых клеток геномной ДНК (в среднем 5-HMC содержание ~ 0,05%)

Компонент	Объем	Конечная концентрация
Воды	_ Мкл
10 X β-GT Реакционный буфер	10 мкл	1 X
До 50 мкг геномной ДНК	_ Мкл	До 500 нг / мкл
UDP-6-N3-Glc (3 мМ)	3,33 мкл	100 мкМ
β-GT (40 мкм)	5 мкл	2 мкМ
Общий объем	100 мкл

III) Для раковых клеток геномной ДНК (низкой 5-HMC содержание ~ 0,01%)

Таблица 1. Примеры количество ДНК входа и маркировке реакций с использованием образцов с различными 5-HMC уровней селективный метод маркировки химических веществ.

Образец	5-HMC уровне	Начиная ДНК (мкг)	Восстановление после маркировки (вход с бисером) (мкг)	Восстановление выход	Выпадающие ДНК (нг)	Выпадающие дают
Взрослые мозжечка мыши	0,4%	10	7,5	75%	236	3,1%
Послеродовая день 7 мышь мозжечка	0,1%	11	9	82%	140	1,6%
Мышь ЭС клеток E14	0,05%	60	42	70%	350	0,8%

Таблица 2. Представитель результаты мыши тканях мозга и ES клеток.

Обсуждение

5-hydroxymethylcytosine (5-HMC) является недавно идентифицированных эпигенетической модификацией настоящего в значительных количествах в определенных типах клеток млекопитающих. Метод, представленный здесь для определения генома распределение 5-HMC. Мы используем бактериофага Т4 β-glucosyltransferase пере?...

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Это исследование было частично поддержана Национальным институтом здоровья (GM071440 в CH и NS051630/MH076090/MH078972 к PJ).

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Имя	Компания	Каталог #	Комментировать
			Реагенты
5M хлорида натрия (NaCl)	Promega	V4221
0,5 М рН 8,0 этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA)	Promega	V4231
1M Trizma базы (Трис) pH 7,5	Invitrogen	15567-027)
1M HEPES, pH 7,4	Invitrogen	15630
Хлорид магния (MgCl ₂₎ 1M	Ambion	AM9530g
Диметилсульфоксид (ДМСО)	Сигма	D8418
Tween 20	Фишер BioReagents	BP337-100
DBCO-SS-PEG3-биотин сопряженных	Нажмите химия Инструменты	A112P3
1,4-Dithiothreitol, сверхчистых (DTT) сверхчистого	Invitrogen	15508-013
QIAquick нуклеотидных Kit Удаление	Qiagen	28304
Micro Bio-Spin 6 колонка	Bio-Rad	732-6222
Dynabeads MyOne	Invitrogen	650-01
Стрептавидин C1
Qiagen MinElute ПЦР Очистка Kit	Qiagen	28004
UltraPure Агароза	Invitrogen	16500500
UDP-6-N _{3-глюкозы}	Активный Motif	55013
			Фермент
β-glucosyltransferase (β-GT)	Новая Англия Biolab	M0357
			Оборудование
Озвучивание устройства	Covaris
Обои для рабочего центрифуги
Водяная баня	Fisher Scientific
Гель работает аппарат	Bio-Rad
NanoDrop1000	Thermo Scientific
Labquake труб Shaker	Barnstead
Labquake труб Shaker	Thermolyne
Магнитная стойка Разделение	Promega	Z5342
Кубит 2,0 Флуорометр	Invitrogen
			Реагент установки 10 X β-GT Реакция буфера (500 мМ HEPES рН 7,9, 250 мМ MgCl _{2) 2} X Переплет и стиральные (B & W) буфера (10 мМ Трис, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА, 2 М NaCl, 0,02% Tween 20) .