Анализируя мышиной сотовых шванновских развития по Растущие аксоны

Резюме

Здесь мы опишем Шванновских клеток (СК) миграции тест, в котором SCs могут развиваться расширения аксонов.

Аннотация

Развитие периферических нервов, интригующий процесс. Нейроны посылают аксоны иннервируют конкретные цели, которых у людей часто являются более 100 см от сомы нейрона. Выживаемость нейронов в процессе развития зависит от целевой факторы роста, но и на поддержку шванновских клеток (СК). С этой целью SC ensheath аксоны из области нейронных сома (или переход от централизованного к периферической нервной системы) к синапса или нервно-мышечного соединения. Шванновские клетки являются производными нервного гребня и мигрируют в качестве предшественников по развивающиеся аксоны, пока весь аксон покрыт SCs. Это показывает важность SC миграции для развития периферической нервной системы и подчеркивает необходимость исследовать этот процесс. Для того чтобы проанализировать SC развитие, установка необходима, который рядом с ТЦ также включает их физиологическим субстратом для миграции, аксона. В связи с внутриутробного развития (муз мышцы). Чтобы обойти это, мы адаптировали верхний шейный ганглий (SCG) эксплантов техники. После лечения с фактором роста нервов (ФРН) SCG эксплантов расширить аксонов, а затем прекурсоров SC мигрируют вдоль аксонов из ганглия к периферии. Красота этой системы является то, что SC выводятся из пула эндогенных SC и что они мигрируют по своим физиологическим аксоны которых растут одновременно. Эта система особенно интригует, потому что развитие SC вдоль аксонов могут быть проанализированы покадровой обработки изображений, открытие дополнительных возможностей, чтобы получить представление миграции SC.

протокол

1. Подготовка Коллагеновые гели

1. Подготовить запас среду, содержащую 455 мкл 10х MEM, 112 мкл 7,5% NaHCO _3, 50 мкл глутамина и NaOH. Концентрация и количество NaOH зависит от крысы хвост коллагена подготовки (см. п. 1.2), окончательный объем фонда среде бытия 1.000 мкл.
2. Подготовка крысы хвост коллагена в соответствии с Ebendal (1). Хранить раствор коллагена при 4 ° C. Деградации коллагена решение не могло быть обнаружено. После подготовки новой партии, оценки концентрации NaOH, необходимого для фондового среды (см. 1.1). С помощью рН-индикатор среда для титрования количества и концентрации NaOH. 800 мкл кислого крысы хвост коллагена придется обратиться оттенок красного цвета при смешивании с 210 мкл фондовом среды. Если концентрация NaOH слишком низкой коллагена решение будет желтеют, в связи с индикатором рН среды. Добавить коллагена для средних и микс без продуктовucing пузыри. Выполните следующие шаги на льду. Полимеризация происходит в течение 2 часов после решения коллагена и фондовых среды были смешаны и новый раствор инкубировали при 37 ° C. Проверьте это перед началом эксперимента. 1,3) смешать 800 мкл раствора коллагена с 210 мкл на складе среды (см. 1.2). Разместить 100 мкл этого раствора в скважинах 8 хорошо слайд камеры. Инкубируйте слайды при 37 ° C, 5% CO ₂ и влажных условиях в культуре клеток инкубатора. Подготовка коллагена гелей под лавку культуре клеток и стерильных условиях. Коллагена gelatinizes в течение 2 часов.

2. Препарирование Эмбриональные SCGs

1. Урожай эмбрионов времени беременных мышей (E16-18) из матки и держать их в PBS до дальнейших необходимости.
2. Проанализируйте один эмбрион от амниона. Обезглавьте эмбриона хвостового из ключичной уровне. Исправить голову на блюде нижней кремния с "насекомое-иглы". Вентральной стороне головы имеет к лицу, чтобы выD Вы должны видеть подчелюстной области. Фиксация позволяет легче подготовки.
3. Снимите кожу подчелюстной области слева и справа и с ним подкожной соединительной ткани.
4. Снимите подчелюстной слюнной железы от их местонахождения, чтобы очистить вид на подъязычную, infrahyoidal мышц и кивательной мышцы.
5. Удалить эти мышцы тщательно очистить вид на гортань и трахею. Удалить трахею и гортань. Сонной артерии, то видны с обеих сторон на предпозвоночные мышц. SCG расположена в бифуркации сонной артерии и имеет овальную форму. Осторожно снимите ганглиев и поместить их в PBS. Снимите ганглиев мягко рассечение инструментов, если они придерживаются их. Это выгодно, чтобы использовать щипцы, а также держатель иглы с установленными на "насекомое игла" для SCG удаления.
6. После того как в PBS, хранить ганглиев при комнатной температуре в PBS, пока вы не расчлененные enouGH ганглиев. Затем очистите ганглиях из кровеносных сосудов и соединительной ткани. Выполните SCG вскрытие и очистка под микроскопом рассечение под скамейку ламинарного потока.
7. Наконец, поместите эксплантированных ганглиев на желатинизированный гелей коллагена с помощью шприца иглы установлен на шприц для легкого обслуживания.
8. Инкубируйте SCG эксплантов на желатинизированный коллагена в культуре клеток инкубаторе при температуре 37 ° C, 5% CO ₂ и влажных условиях.

3. Лечение SCG Экспланты

1. Через 1-2 ч инкубации, накройте SCG эксплантов, содержащие коллаген с 100 мкл культуральной среды Neurobasal ячейку, содержащую добавку B27, глутамин и антибиотики. Теперь скважин камеры слайды содержат объемом 200 мкл (100 мкл геля и 100 мкл среды). Добавить еще 200 мкл среды, однако теперь содержащих NGF (60 нг / мл), чтобы облегчить рост аксонов. Соответственно окончательный NGF концентрация составляет 30 нг / мл.
2. 1. Для исследования наступления SC миграции, добавить дополнительные факторы, непосредственно в день в пробирке 0 (div0). Растворите факторов в среде, содержащей NGF в двойной концентрации, необходимых (2).
   2. Для того, чтобы проанализировать воздействие на КА, которые уже начали мигрировать вдоль аксонов, добавить дополнительные факторы DIV3 до DIV4 (потенциальных остановки эксперимента). Для этого осторожно удалить 180 мкл раствора, в DIV3, и добавить 200 мкл среды, содержащей новые NGF и дополнительные факторы процентов в двойной концентрации (2).

4. Время изображений в заданный промежуток

Используйте инвертированный микроскоп для анализа. Различные цели могут быть использованы, определяющих поля зрения и увеличении. Одним из важных аспектов, однако, является рабочим расстоянием используемого цель, как визуализация SCG эксплантов осуществляется через предметное стекло и коллагенагель. Скорость записи кадра 1/10-30 минут показали хорошие результаты (2). Однако, этот аспект должен быть отрегулирован на научные вопросы. Нормальная ПЗС-камеры могут быть использованы для получения изображений. Для визуализации промежуток времени инкубации культуры клеток камера должна быть прикреплена к этапу микроскопом. Инкубируйте ткани во время съемки при 37 ° C, 5% CO ₂ и влажных условиях. Начало одной инкубационной системы часа до начала обработки изображений. Это позволяет микроскоп части (например, цели), включая камеры слайда, чтобы приспособиться к температуре и предотвращает температуры индуцированной сугробы. Определить конкретные направления анализа (в пределах от эксплантов и между различными эксплантов) с помощью микроскопа программного обеспечения и программно-управляемых моторизованных этапе (многопозиционные установки) для одновременного анализа различных прикладных условия для SCG эксплантов. Для покадровой визуализации дикого типа ткани, а также ткани из трансгенных животных может быть использованамаркировки СКС (S100B: GFP) (3). Для визуализации флуорофоров флуоресцентных источников света должен быть реализован в micropscope установки. Используйте стандартные фильтры.

5. Количественное SC расстояния миграции

1. В конечной точке (DIV4 например), исправить коллагена гель с 4% PFA в камере слайд в течение 3-4 часов. Последовательно мыть коллагена гели 5 раз в течение 10 мин с PBS. Примените стандартные протоколы для иммуноцитохимия (2). Если вы новичок в подготовке SCGs, проверять личность ганглий, как симпатические ганглии с помощью иммуногистохимии против тирозингидроксилазы (TH) общего маркера катехоламинергических клеток. Во время иммуногистохимии (после первичного антитела), передает эксплантов содержащих гелей коллагена в 24-луночные планшеты, которые имеют больший объем, что выгодно для мытья гелями.
2. После иммуногистохимии, осторожно поместите коллагена гелей на стеклах. Осторожноудалите остатки раствора и пусть коллаген сухой / сократится до двух измерениях. Это позволяет легко измерений расстояний (2). После этого, установите образцов.
3. Наконец, измерения миграции расстояния с помощью Фиджи (NIH) программного обеспечения. Никаких специальных плагинов необходимых для этой цели. Для обеспечения правильного измерения в мкм, проверить правильность метаданных изображений и настройки в соответствии с Фиджи, изображения и масштаба. Используйте Фиджи также для количественного определения клеток.

Результаты

Рост аксонов облегчается от SCG эксплантов при обработке NGF (4) (фильм схеме S1 рисунке 1 схемы). Этот процесс хорошо виден на любой инвертированный микроскоп и может сопровождаться замедленной съемки (фильм S2). Если ученый является новым для рассечения SCG из мышиных эмбрио...

Обсуждение

Развитие периферической нервной системы является захватывающим процессом. При развитии завершен, аксоны ensheathed по SCs по всей длине, которая может, у людей, часто более 100 см. Для этого нужное количество необходимых SCs должно быть установлено в процессе разработки и SCs также должны двигать...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название Реагенты / Материал	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
10x MEM	Gibco	21430
Бикарбонат натрия (7,5%)	Gibco	25080
Глутамин	Gibco	25030
NaOH	Merck	109137
NGF	Roche	1058231	R & D # 556-NG-100
Средний Neurobasal	Gibco	21103
B27 дополнения	Gibco	17504
антибиотики	Gibco	15640
D-PBS	Gibco	14040
насекомое иглы	FST	26002-20
иглу шприца	Braun		BD # 300013
8 хорошо слайд камеры	Лаборатория тек	177402