Порядок Decellularization свиного сердца, ретроградная коронарная перфузия

Резюме

Метод для быстрого и полного удаления клеточных компонентов из сердца свиньи нетронутым через ретроградной перфузии описано. Этот метод дает конкретного участка сердечной внеклеточного матрикса леса, который имеет потенциал для использования в различных клинических применений.

Аннотация

Перфузии на основе целого decellularization орган недавно получил интерес в области тканевой инженерии в качестве средства для создания конкретных участков леса внеклеточной матрицы, в то время как в значительной степени сохранение родного архитектуры на эшафот. На сегодняшний день, данный подход был использован в различных системах органов, включая сердце, легкие, печень и ^1-5. Предыдущие методы decellularization для тканей, не легко доступны сосудистой сети, сделали ставку на длительном воздействии ткани для решения моющих средств, кислот, или ферментативного лечения в качестве средства для удаления клеточных и ядерных компонентов из окружающей внеклеточной среды ^6-8. Однако эффективность этих методов навесной на способность решения проникать в ткани с помощью диффузии. В отличие от перфузии органов через естественные сосудистой системы эффективно уменьшить расстояние диффузии и способствовали перевозки decellularizatiна веществ в тканях и клеточных компонентов из ткани. Здесь мы опишем метод, чтобы полностью decellularize нетронутыми сердца свиньи через коронарные ретроградной перфузии. Протокол дали полностью decellularized сердечной внеклеточного матрикса (С-ECM) эшафот с трехмерной структурой сердце нетронутой. Наш метод использовался ряд ферментов, моющих средств, и кислоты в сочетании с гипертонической и гипотонической полоскания, чтобы помочь в лизис и удаление клеток. Протокол, используемый раствор трипсина чтобы отделить клетки от матрицы следует Triton X-100 и натрий решения дезоксихолата, чтобы помочь в удалении клеточного материала. Описанный протокол также использует перфузии скоростью более 2 л / мин в течение длительных периодов времени. Высокая скорость потока, в сочетании с решением изменения позволили транспортных агентов в тканях без загрязнения клеточных обломков и обеспечить эффективное полоскание тканей. Описанный способ удалить все ядерные материалы от Нативе свиного сердечной ткани, создавая сайт-специфической сердечной ECM эшафот, которые могут быть использованы для различных применений.

протокол

1. Подготовка ткани и настройки эксперимента

1. Урожай свиного орган сразу же после эвтаназии от объекта бойне или научно-исследовательских и смыть избыток крови. Обрежьте сердце лишний жир и ткани, сохраняя предсердия и аорты без изменений. Обрежьте жир для отделения легочной артерии от аорты. Если есть какие-либо сокращения в ткань, удалить надлежащим образом.
2. Оберните каждую сердце индивидуально в морозильной камере бумагу и хранить все ткани в -80 ° C морозильнике в течение по крайней мере 24 часа в сутки, чтобы обеспечить полное замораживание.
3. Когда все будет готово для использования (как правило, менее чем за 3 месяца), оттепель один неповрежденный замороженной свинины в сердце Type 1 воде на ночь погруженный в 4 л стакане при температуре 4 ° C.
4. После того, как сердце полностью оттаять, погладить сердце сухо, вес сердца, и запишите вес. Сердце свиньи весом рынке должна весить приблизительно 375-450 гр.
5. Подключите размер 18 Masterflex трубки к ¼ "конца колючей редуктора. Вставьте колючей редуктора итрубка внутри аорты. 2 место хомутов или безопасной связи почтовый индекс вокруг аорты, чуть ниже брахиоцефальных ствола. Редуктора и трубы должна оставаться выше аортального клапана, так коронарных артерий может быть перфузии (рис. 1).
6. Используйте 30 или 60 мл шприц, чтобы заполнить трубопровод с I типа воды. Вставьте трубку в картридж насос Masterflex ролик на ее приближенные середине. Погрузитесь приток конец трубки в нижней части 4 л стакан наполнен 2,5 л воды и закрепить трубку.
7. Поместите сердце в стакан наполнен водой, и премьер-насос для удаления пузырьков воздуха. Если пузырьки наблюдаются ближайшие от аорты, где трубка вставляется, аорты, возможно, придется изменить или крепится с помощью дополнительных связей. Герметичность важно поддерживать достаточное давление во время decellularization процесса (рис. 2).
8. Поместите 4 л стакан, содержащий 3 л 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3 Решение о мешалки и прогрейте его до 37 ° C в подготовке decellularization процесса.

2. Ткань Полоскания

1. Установить насос с расходом 400 мл / мин, что обеспечивает правильный размер трубы выбран. Промойте сердце с I типа воде в течение 15-25 мин. Как насос, сердце должно набухать и изливать кровь из желудочков. Свежее решение должно быть заменено каждые 5-10 минут, или по мере необходимости в зависимости от количества крови удалены от сердца. Если кровь не изливается из сердца, отрегулировать трубки и зажимы по мере необходимости.
2. Остановите насос и передать сердца в отдельный стакан наполнен 2X фосфатным буферным раствором (PBS). После того, как трубка погружена в раствор, включить насос и увеличить скорость потока до 700 мл / мин. Сердце должно оставаться в растворе в течение 15 мин, меняя раствора каждые 5 мин. Каждое решение требует изменения насос будет остановлен временно, пока ткань и трубки перемещаетсяна новый стакан.
3. Передача сердце тип I воде в течение 10 мин и увеличить скорость потока до 750 мл / мин.

3. Decellularization и решение Perfusion

1. Передача сердце в стакан, содержащий 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN ₃ при температуре 37 ° C. Увеличение скорости насоса до 1200 мл / мин и запустить насос. Используйте мешалкой помещают на дно стакана распространить решение в стакан. Сердце должно оставаться в 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN ₃ раствора при 37 ° С в течение в общей сложности три часа. Через 1 час, увеличить скорость насоса до 1500 мл / мин. После дополнительного часа, увеличить скорость насоса до 1800 мл / мин. Ткань постепенно подвергается увеличилась скорость перфузии в состоянии тканей и предотвратить разрыв сосудов. Сердце будет набухать и почти в два раза в размерах во время этого шага протокола. Ткань потеряет свой естественный цвет, прогрессируя от предсердий к вершине по всему гоэлектронной протокола (рис. 3).
2. После каждого решения перфузии, в два этапа полоскания выполняется для удаления продуктов распада клеток, химических остатков, и лизис помощи клеток. Каждый промыть состоит из 10 минут промыть в I типа воды, а затем 10 мин смойте 2X PBS раствора при комнатной температуре. Каждое мытье состоит из удаления раствора из оригинальных стакана, добавив, промыть решения, и оборотных перфузат в стакан, содержащий погруженный сердце. После того, 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN ₃ раствора, заливать воду в 1900 мл / мин, а затем заливать 2X PBS на 1950 мл / мин.
3. Передача сердце раствор 3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN ₃ при комнатной температуре. Увеличение скорости насоса до 2000 мл / мин и заливать раствор в течение одного часа. Удалить раствор из стакана и заменить свежим раствором, увеличить скорость насоса до 2100 мл / мин, и заливать свежее решение для дополнительного полтора часа, в результате чего общее время в3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN ₃ до 2,5 часов.
4. Промойте ткань в I типа воды при 2150 мл / мин и 2X PBS в 2180 мл / мин в течение 10 минут каждый.
5. Передача сердца к 4% раствор натрия Deoxycholate при комнатной температуре. Увеличение скорости насоса до 2200 мл / мин и заливать раствор в течение 3 часов.
6. Промойте ткань в I типа воды и 2X PBS на 2200 мл / мин в течение 15 минут каждый, изменение решения через 5-10 мин для каждого решения. Описанные шаги перфузии может быть разделена на несколько дней, выполняя шаг дважды промыть и хранении сердца с прикрепленной трубкой в ​​течение ночи при температуре 4 ° С и погружают в I типа воды.
7. На следующий день, выполнить 5 минут смойте водой типа I при 750 мл / мин, а затем на 5 минут промыть в 1X PBS в 1500 мл / мин. Протокол может быть продолжено на описанные скорость потока в соответствующем решении.

4. Дезинфекция и окончательная обработка

1. Передача сердца 0,1% peracуксусной кислоты / 4% раствор этанола и заливать раствор в течение 1,5 ч при 2200 мл / мин.
2. Окончательный полосканий для тканей всех выполненных на 2200 мл / мин. Заливать ткани с 1X PBS в течение 15 мин, а затем два 5 минут моет в I типа воды. Эта серия полоскания повторяют еще раз, чтобы завершить процедуру решения перфузии.
3. Поверните насос и снимите сердце от решения слить сердца. Вырезать связи от аорты, удалить все трубы, и поместить сердце в пустой стакан для слива в течение 1 часа. Избыток жидкости будет необходимо периодически сливать. Положите сердце на впитывающей прокладки, чтобы полностью слить сердца (рис. 4).
4. После того, большая часть воды удаляется, запишите вес сердечно внеклеточного матрикса (C-ECM). Сердце может быть как ожидается, потеряет около 20-25% от своего первоначального веса во время decellularization процесса.
5. Проанализируйте правого и левого желудочков, а также межжелудочковой перегородки для ДНК quantificatiна и гистологической обработки для того, чтобы подтвердить полное decellularization ткани (рис. 5).
6. Замораживание C-ECM при -80 ° C в течение по крайней мере 2 часа до лиофилизации.

Результаты

Эффект decellularization по всем сердцем свиньи, естественно, варьируется из-за различий в размерах, давления и судно договоренности. Таким образом, точный состав производного внеклеточной матрицы леса не будет таким же, от сердца к сердцу. Завершения описанных протокола даст сердца, которая п?...

Обсуждение

Данное исследование описано методология последовательной и эффективной decellularization из свиного сердца. Протокол был модификацией ранее опубликованного отчета ^1, и включить больше воздействием потока и повышения давления, в котором содержится более воспроизводимые результаты. Пол...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название Реагенты / Материал	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
Трипсин	Gibco	15090
EDTA	Рыбак	BP120-500
NaN 3	Сигма	S2002-500G
Triton X-100	Сигма	X100-1L
10X PBS	Рыбак	BP399-20
Натрий Deoxycholate	Сигма	D6750-500G
Надуксусной кислоты	Pfaltz и Бауэр	P05020	35% CAS # 79-21-0
Этанол	Pharmco	111000200
Masterflex Привод насоса	Cole Parmer	SI-07524-50
Masterflex труб	Cole Parmer	96400-18	Размер 18
Колючая редуктор	Cole Parmer	EW-30612-20
Стакан 4L	Fisher Scientific	02-540T