Визуализация эндоплазматического ретикулума Локализованные мРНК в клетках млекопитающих

Резюме

Здесь мы опишем метод визуализации эндоплазматическая сеть связанных мРНК в клетках млекопитающих культуре ткани. Эта методика включает в себя селективный проницаемости плазмы мембраны с дигитонина удалить цитоплазматического содержимого последующим флуоресцентным На месте Гибридизации для выявления объемных или поли (А) мРНК или конкретных стенограммы.

Аннотация

У эукариот, большинство из РНК, (мРНК), которая кодирует выделяется и мембранные белки локализованы на поверхности эндоплазматической сети (ER). Тем не менее, визуализации этих мРНК может быть сложной задачей. Это особенно верно, когда только часть мРНК ER-ассоциированных и их распределение этой органеллы затруднен нецелевой (т.е. "свободный") стенограмм. В целях контроля ER-связанных мРНК, мы разработали метод, при котором клетки обрабатывают с коротким воздействием решение дигитонина добычи, избирательно permeabilizes плазматической мембраны, и таким образом снимает цитоплазматического содержимого, при одновременном сохранении целостности ER . Когда этот метод в сочетании с флуоресцентной гибридизации (FISH), можно четко визуализировать ER-связанного мРНК методом флуоресцентной микроскопии. С помощью этого протокола степени ER-ассоциации либо объемных поли (А) транскриптов или конкретных мРНК может быть оцененаи даже количественно. В этом процессе можно использовать этот анализ для исследования природы мРНК-ER взаимодействия.

Введение

У эукариот мРНК, кодирующей выделяется и мембранных белков могут быть направлены на ER совместно трансляционно частицей ^1,2 признание сигнала и может быть сохранен на ER через прямое взаимодействие между рибосомами и translocons во время перевода ^3,4. Однако, независимо от мРНК могут быть направлены и поддерживается на ER зависит ни от рибосомы или перевода была неясна до самого последнего времени. Предыдущие исследования пытаются решить, есть ли перевод независимой мРНК связи с использованием ER сотовой методы фракционирования. Из-за суровых условиях химического должны были отделиться от рибосомы ER, полученных пузырьков, которые могут нарушить тонкий потенциально мРНК-ER ассоциации, эти исследования не дали результатов, что свидетельствует в течение ^5-8 и против ^9,10 рибосомных независимых закрепления мРНК ER .

Чтобы обойти эти проблемы мы разработали протоцв, чтобы изолировать и изображения ER-связанного мРНК. Эта процедура включает в себя мягкий лечения добычи, которая эффективно удаляет все цитоплазматического содержимого ячейки (в том числе не связанных ER-мРНК) при одновременном сохранении ER морфологии и все связанные с ней молекулы. С помощью этого протокола мы продемонстрировали, что подмножество мРНК ориентированы, а затем поддерживается на ER независимо от рибосомы или перевод ^11.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка материалов для добычи

1. Подготовка клетки
   1. Семенной культуре ткани клеток на обработанных кислотой покровные по крайней мере, за один день до эксперимента. Мы используем COS-7 или U2OS, так как эти две клеточные линии обладают надежной продукции секретируемых белков и имеют четко определенные ER. Обратите внимание, что для достижения высокой эффективности добычи, клетки не должны превышать 80% слияния на покровное в день эксперимента.
   2. Если конкретный экзогенных мРНК находится в стадии расследования, клетки трансфицируют один день после посева с плазмиды, содержащие ген, представляющий интерес, используя стандартные протоколы трансфекции. Затем клетки позволили выразить мРНК, по крайней мере 18 часов до извлечения.
2. Обработки клеток Перевод ингибиторы
   1. Чтобы проверить эффект нетронутыми рибосомы на содержание мРНК связи с ER, клеток можно лечить с помощью перевода ингибиторы, которые нарушают ассоциациирибосом с мРНК ^11.
   2. Ингибиторы инициации трансляции, такие как homoharringtonin (ННТ), pactamycin, или 2 - (4-метил-2 ,6-dinitroanilino) - N-methylpropionamide (MDMP), предотвратить новые рибосомы от общения с стенограмму одновременно позволяя заниматься рибосомы, чтобы Полный перевод ^12-14. Так как перевод ставка для большинства белков в клетках млекопитающих составляет 5 аминокислот в секунду, независимо от кодонов или мРНК длиной ^15, лечении 30 мин необходимо очистить от рибосомы сообщений с открытых рамок считывания до тех пор, 27000 нуклеотидов (кодирующих белки тех пор, как 9000 аминокислот).
   3. Ингибиторы, такие как пуромицин способствовать преждевременному выбросу зарождающейся цепи и таким образом сорвать полисом ^12. Однако, чтобы полностью разрушить ассоциации пуромицин обращение рибосомы с мРНК, магния энтеросорбенты, такие как ЭДТА должна быть добавлена ​​в буфер дигитонина добычи ^11.
   4. В этом эксперименте клетки обрабатывали 200 мкМ пуромицин, 5 мкМ HHT или контрольной среды в течение 30 мин до извлечения.
3. Подготовка буфера для экстракции дигитонина. Для визуализации ER-локализованных мРНК без препятствий свободной (то есть цитоплазматическая, не ER-попутного) стенограммы, мы выборочно permeabilize ячейки с дигитонина, стероидный гликозид, который взаимодействует преимущественно с 3β-hydroxysterols. При низких концентрациях дигитонина выборочно permeabilizes части плазматической мембраны, в результате чего "неплотности" ^16. В отличие от мембраны ЭР и ядерной оболочки, которые бедны холестерином, остались нетронутыми ^16,17.
   1. Дигитонина (Sigma Aldrich) порошок растворяют в дистиллированной воде при 5% вес / объем, и это маточный раствор аликвоты в небольших объемах и хранится в -20 ° C. По нашему опыту, нескольких циклов замораживания-оттаивания снижает эффективность растворения дигитонина.
   2. Исходный раствор10-кратный буфер CHO (1x рабочий раствор концентрацией: 115 мм Кац, 25 мМ HEPES рН 7,4, 2,5 мМ MgCl _2, 2 мМ EGTA и 150 мМ сахарозы) получают с РНКазы реагентов и хранить при температуре -20 ° C. Рабочий раствор (1x CHO буфера) получают путем разбавления раствора с РНКазы свободной воды и может храниться при температуре 4 ° C.

2. Добыча дигитонина

1. Подготовка Добыча решения
   1. Нагревательный блок с плоской поверхностью предварительно нагретой до 40 ° С и выдерживают при этой температуре в течение с добычей.
   2. Для формирования плоской рабочей поверхности, что является РНКазы свободной, нагревательный блок смачивают небольшим количеством воды и выложил свежий кусок парафильмом M (Bemis Company, Inc). Пузырьки воздуха между листом парафильмом и отопление Блок сглаживаются использованием РНКазы перчатки и Kimwipes (VWR).
   3. 1x CHO буфера нагревают до 37 ° С путем инкубирования в водяной бане.
   4. 6-луночные планшеты используются для мытьяи исправить клетки. Каждая строка 3 скважины используются для одной обложкой скольжения. Для первых двух скважин в ряду, 2 мл подогретого буфера CHO добавлен. Для последних также, 2 мл фиксации решения (PBS + 4% параформальдегида (Electron наук микроскоп)) добавляется. Этот лоток могут быть сохранены в 37 ° С инкубатор пока клетки готовы к добыче.
   5. Дигитонина добычи раствор готовят путем разбавления раствора дигитонина до 0,025% с теплой CHO буфере непосредственно перед использованием. Опять же отметим, что для пуромицин обработанные клетки, извлечение буфер должен содержать дополнительно 20 мМ EDTA эффективно разрушать рибосомы ^11. Капли 100 мкл экстракционного раствора помещают на покрытые парафином нагревательный блок непосредственно перед добычи.
2. Добыча дигитонина и фиксации клеток
   1. Удалить клеток от 37 ° C инкубатора.
   2. Во время процесса экстракции, покровные манипулируют с помощью щипцов jewler автора. СЩипцы подобрать покровное и опустите ее в первый, а затем второй и содержащие CHO буфера, чтобы вымыть из питательной среды.
   3. Быстро промокните лишнюю буфера от задней стороне покровного стекла с Kimwipe и сразу же поместить покровное, сотовые стороной вниз, на добычу решения.
   4. Через 10 секунд, поднимите покровное с помощью пинцета и сразу же передать его, клетки вверх, к лунке, содержащей 4% буфера крепления параформальдегида.
   5. Пусть образец инкубируют в фиксатор в течение 15 мин при комнатной температуре.
3. Подготовка неэкстрагированных контрольными клетками. Для определения общего количества мРНК в цитоплазме, что это хорошая идея, чтобы подготовить неэкстрагированных контрольного образца.
   1. Клетки, выращенные на покровных готовят, как указано выше (см. раздел 2.2), кроме того, что шаг дигитонина добычи (2.2.3) пропускается.
   2. После фиксации ООН извлеченные клетки должны быть проницаемыми в PBS + 0,1% TritonX-100 в течение 15 мин при комнатной температуре.

3. FISH окрашивания

1. Проектирование датчиков для флуоресценции в гибридизация
   1. Первичной последовательности мРНК заинтересованных складывается с помощью РНК вторичного программного обеспечения предсказания структуры, такие, как RNAstructure 5,0 ^18. МРНК складки визуально оценивать для выявления области около 50 нуклеотидов, свободное от основной вторичной структуры.
   2. Обратный дополнением этого региона синтезируется с Alexa546 флуорофора прикреплен к 5 'концу зонда (приобретенный у интегрированные технологии ДНК).
   3. Зонд разбавляют РНКазы свободной воды в запасе концентрации 100 мкМ, которые могут храниться при температуре -20 ° C.
2. Окрашивание с рыбой зондов
   1. Заметим, что хотя дигитонина экстракты клеток не требует дальнейшего проницаемости, рассматривая эти основные образцы с 2 мл 0,1% Triton X-100 разводили вPBS в течение 15 мин при комнатной температуре до FISH окрашивания, помогает снизить фоновый сигнал.
   2. Слайдов, затем дважды промывают PBS, чтобы удалить остатки параформальдегид или Triton X-100.
   3. Затем клетки промывают два раза с 25% до 60% формамида в 1X цитрат натрия буфера (150 мМ NaCl и 15 мМ цитрат натрия). Как правило, для специфических зондов рыб, которые составляют 50-60 нуклеотидов в длину, 60% формамид используется, но для поли (А) мРНК окрашивания олиго (дТ) FISH зонд, уровень формамида снижается до 25%.
   4. Для подготовки окрашивания камеры, в нижней части на 150 мм блюдо Петри покрыта водой и кусок парафильмом будет плавали на воде. Вода удаляется при повороте на блюдо, тем самым позволяя парафильмом присоединиться к нижней части блюда. Пузырьки воздуха удаляются вручную с Kimwipes.
   5. Для каждого покровное для окрашенных, пипетки 100 мкл каплю раствора, содержащего гибридизации зонда FISH интереса на номинальнуюafilm в окрашивании камеры. Зонд рыбных запасов разбавляют 25% до 60% формамида в гибридизации буфера (1х SSC, 100 мг / мл декстрана сульфата, 1 мг / мл тРНК дрожжей, 5 мМ комплекса ванадила riboside, 25-60% формамид) до рабочей концентрации 0,2 мкм. Обратите внимание, что количество формамида должны быть оптимизированы для конкретного зонда используется и находится в той же концентрации, что и в буфере SSC стирки (см. п. 3.3.3).
   6. Покровное стекло помещается лицом клетки вниз на FISH решения в окрашивании камеру и выдерживают в течение 5-24 часов при 37 ° C в увлажненной камере, такие как тканевая культура инкубатора.
3. Стиральные и монтаж окрашенных образцов
   1. Для подготовки РНКазы зоны свободной мойки, легла полоса парафильмом на уровне плоской поверхности, например, лаборатории скамейке. Для того, чтобы парафильмом плоская, мокрый ровной поверхности, поместите парафильмом сверху и вручную удалить все пузырьки воздуха с Kimwipes.
   2. Окрашивание камерыудалить из инкубатора и помещен на ровной поверхности. Покровные затем плавал с помощью пипетки около 500 мкл промывочного буфера FISH на краю каждого покровное. Решение будет составлен в период между покровным и парафильмом с помощью капиллярного действия.
   3. Для каждого покровное, 1 мл промывочного буфера (1х SCC с 25-60% формамида, см. шаг 3.3.3) с помощью пипетки на стиральную области парафильмом (см. п. 3.4.1).
   4. Используя щипцы, покровные удаляются из камеры окраски и каждый помещается на каплю моющего буфера и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин. Стиральная процесс повторяется 3 раза.
   5. Предметные стекла промывали 70% этанолом и высушивали с Kimwipes.
   6. Для каждого покровное, 25 мкл монтажных решений (DAPI Fluoromount G, Southern Biotech) с помощью пипетки на слайде. Обратите внимание, что это решение содержит 4 ',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), который окрашивает ДНК и позволяет для визуализации ядер.
   7. Усинг щипцы и Kimwipes, в задней части покровного сушат и избыток промывочного буфера рыбы смыл с без сушки образца. Каждый покровное затем помещают клетки стороной вниз, на падение монтажные решения.
   8. Конная Затем образцы маркированы и могут быть хранить при 4 ° C.

4. Визуализации и количественной

1. Изображениями
   1. Эпифлуоресцентной микроскоп используется для изображения клеток после FISH окрашивания. Трансфицированные клетки могут быть дифференцированы от нетрансфицированных клеток яркий флуоресцентный сигнал в соответствующем канале. В идеале, каждый приобретенный поле будет также содержать нетрансфицированных ячейки, которые будут использоваться для определения фоновой флуоресценции для количественной оценки.
   2. Для каждого поля изображения рыб и DAPI канал приобрел. Кроме того, если клетки совместно окрашенных белковых маркеров, образ иммунофлюоресценции канала также приобрели. Обратите внимание, что дигитонина добычи также может быть использованадля визуализации ER-связанного белка рибосом и ^11.
   3. Чтобы убедиться, что интенсивность флуоресценции между полями можно сравнить, время экспозиции для каждого канала должна оставаться постоянной для каждого набора опыта.
   4. Опять же для того, чтобы флуоресцентные интенсивности между клетками на разных покровные можно сравнить, изо дня в день изменения в интенсивности эпилюминесцентной или распада в рыбе сигнал должен быть минимизирован путем визуализации все покровные в один присест.
2. Количественное. Для определения количества мРНК, которая локализуется на ER, мы используем Nikon NIS элемента программного обеспечения. Однако другие программного обеспечения для анализа изображений, такие как ImageJ может быть использован.
   1. Использование элемента Nikon NIS инструмент анализа изображений, периферии клетки и ядра, изложены как отдельные области интересов (РИ).
   2. Для каждого ROI, интенсивность флуоресценции (I _T для полной интенсивности клетке, и я _п дляядерные интенсивности) и области _(Т и _N) записываются и экспортировать в таблицу Excel.
   3. Для каждого изображения, фон интенсивность флуоресценции (I _B) определяется путем регистрации интенсивности, не трансфицированных клеток. Если поли (А) уровня мРНК в настоящее время анализируются, бесклеточной область выбрана.
   4. Общая сумма ER (в извлекаются клетки) или цитоплазматические (в неэкстрагированных клеток) флуоресценции рассчитывается по формуле:
      _[T] [I _T - I _B] - _{[N] [N} I - I _B]
   5. Ядерные интенсивности окрашивания можно также рассчитать и использовать в качестве внутреннего контроля между различными процедурами. Поскольку ядра не влияет на дигитонина лечения ¹⁷ или нарушением рибосомы ^11, количество ядерных мРНК должно оставаться постоянным между каждой из этих процедур. Для расчета ядерной флуоресценции используется следующая формула:
      _{[N] [N} I - IB]
   6. Процентов цитоплазматических мРНК, которая является ER-целевого может быть рассчитана как среднее флуоресценции ER извлечены из 30-40 клеток (см. 4.2.4), деленное на среднее цитоплазматических флуоресценции от 30-40 неэкстрагированных клеток (опять же см. 4.2.4) . Очень важно, чтобы извлечь и неэкстрагированных клетки готовы, окрашенных и изображается в параллель.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Для определения процентного содержания мРНК, которая является ER-связанные, COS-7 клетки, которые трансфицировали плазмидами, которые содержали плацентарной щелочной фосфатазы (ALPP) или цитохром P450-8B1 (CYP8B1) были либо экстрагируют дигитонина и затем фиксировали, или непосредствен?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Локализация мРНК в различных субклеточных сайтов, через взаимодействие с белками стенограммы мРНК локализации, является широко распространенным явлением важна для правильной сортировки белков в конечный пункт назначения, а также для тонкой настройки экспрессии генов в местные треб?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.