Маркировка отдельных клеток в центральной нервной системе<em&gt; Дрозофилы</em

Резюме

Мы представляем технику для маркировки отдельных нейронов в центральной нервной системе (ЦНС) Drosophila Эмбрионов, которая позволяет проводить анализ морфологии нейронов либо проходящем свете или конфокальной микроскопии.

Аннотация

В этой статье мы расскажем, как индивидуально маркировать нейронов в ЦНС эмбриональные дрозофилы по juxtacellular введения липофильных флуоресцентных маркеров DiI мембраны. Этот метод позволяет визуализировать морфологию клеток нейронов в мельчайших подробностях. Можно пометить любую ячейку в ЦНС: клеточных тел нейронов-мишеней визуализируются при DIC оптики или выражение флуоресцентные генетических маркеров, таких как GFP. После маркировки, DiI может быть преобразована в постоянный коричневое пятно на фотопреобразования, чтобы позволить визуализации морфологии клеток в проходящем свете и DIC оптики. Кроме того, DiI-меченых клеток можно наблюдать непосредственно с конфокальной микроскопии, позволяющий генетически введен флуоресцентных белков репортер, чтобы быть colocalised. Этот метод может быть использован в любое животное, независимо от генотипа, что делает его возможным для анализа мутантных фенотипов на одной резолюции клетки.

Введение

Знание морфологии нейронов на уровне отдельных клеток является ключевым условием для понимания нейронных соединений и ЦНС функции. Таким образом, с первых дней неврологии, исследователи стремились развивать одну ячейку маркировка техники (см. ⁷ для исторических лечения этого вопроса). Классические методы, такие как окрашивание Гольджи обеспечивают превосходное разрешение морфологии нейронов, но не подходит, если один пытается маркировать определенный тип нейронов в направленном образом, как окрашивание происходит случайным образом. Разработка методов окрашивания отдельных клеток или внутриклеточных juxtacellular введения красителей из микроэлектродов обратился к требованиям конкретной маркировки.

Применение однократной инъекции нейрона красителя Drosophila представлены основные проблемы, из-за малого размера и организм и его нейронов. Тем не менее, одно окрашивание нейронов эмбрионального Drosophila Нейроны были достигнуты в середине 1980-х годов в лаборатории Кори Гудман ^15. Хотя метод был высшей полезно и предоставило некоторые ключевые идеи в механизмах нейронального развития у дрозофилы в течение последних 20-30 лет ^{(2, например, 10),} многие рабочие уклонялись от этого, в основном из-за его технических требований.

Наличие в последние годы генетические методы для маркировки нейронов дрозофилы также способствовало непопулярности одной инъекцией красителя нейрона. GAL4-направленной экспрессии мембранных ориентированных конструкций GFP может обеспечить превосходное разрешение нейронной морфологии ^{1, 20.} Однако, этот метод имеет некоторые ограничения: часто неизбежны выражения GFP в несколько ячеек можно скрыть структуру отдельных нейронов и GAL4 драйвер линии могут быть доступны не ездить выражение в конкретных нейронов интерес. MARCM (Mosaic анализ с Repressible Маркер Cell) метод ⁸ может обеспечить маркировку практически любого нейрона на уровне отдельной клетки, но не может быть успешно использован в зародыше и в начале личинки из-за медленного оборота GAL80 белка.

Учитывая эти ограничения генетической маркировки, мы считаем, что однократное введение красителя нейронов у эмбрионов Drosophila остается ценной техники и заслуживает более широкого применения. Для продвижения этой цели, мы предоставляем здесь подробное описание метода. Иллюстрация из его питание обеспечивается нашей недавней счет морфологии полный набор интернейроны в брюшной neuromeres конца эмбриона Drosophila ^14. Это исследование, которое показало, как морфологической изменчивости отдельных нейронов типов клеток и принципы организации neuromere в ЦНС эмбриона, не были бы возможны с любым другим в настоящее время маркировки методом.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Мы использовали два несколько разных вариантов одного метода маркировки нейронов в наших лабораториях. Различия касаются эмбрионов, dechorionisation, devitellinisation и шаги эмбриона филе. Рисунок 1 дает обзор общих и расходящиеся шагов из вариантов.

1. Подготовка микро-иглы для Dissection эмбрионов и микропипетки для краски инъекций

1. Стекло иглы для эмбриона рассечения взяты из стеклянных капилляров (1 мм и 0,1 мм толщины стенки) с Sutter съемник (Science Instruments) или сопоставимые оборудования. Кроме того, электролитически заостренные 0,15 мм вольфрамовой проволоки устанавливается в держатель иглы используются для вскрытия. (Инструкция для электролитического заточки приведены в ^9).
2. Краска микропипетки инъекций взяты из тонкостенных стеклянных капилляров с внутренним нитей (наука продукции; GB 100 TF 8P) с Sutter съемник (ScienceInstruments) или сопоставимые оборудования. Наконечником микропипетки должны быть острыми, с постепенным, равномерным конусности хвостовика, чтобы помочь прохождении через ткани эмбриона. Желаемой микропипетки является "High Микроэлектродные сопротивления, Sharp и Long" сорта, как описано на стр.20 из пипетки Sutter инструмента Поваренная книга ручной ( http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf ). Как правило, микропипетки тянут незадолго до инъекции проводятся с целью обеспечения их советы остаются острыми и чистыми.

2. Сбор, монтаж и Dissection эмбрионов

1. Эмбрион Collection. Мы успешно использовали метод нейронных инъекции описанным здесь, в эмбрионы из этапов от 12 до 17 ^3. Эмбрионы развиваются постепенно кутикулы во время первого этапа 17 и становится все труднее анализировать. Две альтернативные подходы, которые можно получить EMbryos в определенной стадии развития.
   1. Разрешить мухи откладывают яйца в ночь на яблочный сок-агара покрытый дрожжей пасты. Отрегулируйте температуру сбор яиц в соответствии с запланированной время инъекции на следующий день. Соберите все яйца на следующий день и выберите эмбрионов в нужной стадии, используя морфологические критерии ^3.
   2. Разрешить мух лежал на агар, как указано выше, но замените агар пластины с свежая каждые 1,5 часа при 25 ° C. Инкубируйте каждую пластину в течение определенного периода времени, пока эмбрионов достигли стадии развития требуется.
2. 1. Химическая Dechorionation. С помощью металлического шпателя, чтобы очистить эмбрионов от агара и передавать их в стеклянный сосуд (например, чашку Петри или полость блока), содержащий приблизительно 10 мл Drosophila звонка или фосфатным буферным раствором (PBS) решение. Добавить несколько капель концентрированной хлорной извести и агитировать за несколько минутповоротной платформы до хориона лугам у эмбрионов. Промойте эмбрионы в несколько смен Ringer / PBS, пока нет никакого запаха остаточного отбеливателя. Во время этих моет, убедитесь, что эмбрионы не вступают в контакт с поверхностью жидкости. В противном случае, они будут плавать и становится все труднее погружаться для последующей манипуляции. Кроме того, химические dechorionation может быть осуществлено с использованием корзины методике, описанной ^4.
   2. Механические dechorionation (см. Рисунок 2, шаги 1-4). Передаче эмбрионов из чашки с агаром на слайд покрыта двухсторонней клейкой лентой. Избегайте передачи агар с эмбрионами, как он будет мешать их адгезию к ленте. Разрешить эмбрионов высохнуть в течение 5 до 10 минут, пока хорион становится немного хрупким. (Ожидая, пальто покровное необходимых для последующего devitellinisation с клеем - 2.3B см. ниже). Коснитесь каждого эмбриона осторожно с помощью иглы. Хориона будут разделены открытыми и эмбрион будет прилипать к пеEdle. Трансфер эмбрионов немедленно агар блока, чтобы предотвратить высыхание и выровнять около 10 из них подряд, с брюшной стороны вверх.

Devitellinisation и филе производится вручную, используя один из двух методов, описанных в 2.3A и 2.3B.

3. 1. Передача одного эмбриона dechorionated соответствующей стадии развития от блюдом раствор Рингера несколько капель Ringer в силиконовой плотины на заранее подготовленные стекле микроскопа. (Сделайте 3 см, площадь Дам, смазывая тонким слоем силиконового герметика на предметное стекло микроскопа, затем добавить каплю 0,01% поли-L-лизин решение центре плотины. Разрешить силиконовые вылечить в течение 24 час.) Трансфер эмбрионов со стеклянной пипетки Пастера, гарантируя, что зародыш остается под поверхностью Ringer в процессе передачи.
      Приготовьтесь к заднему концу зародыша с парой тонких щипцов, мягко SqueezING эмбриона с парой тонких ножниц иридэктомия, около четверти пути назад от его переднего конца. Не режьте прямо через эмбриона. Цель состоит в том, чтобы просто взломать желточной мембраны в то время как наносящие минимальный ущерб для эмбриона. С помощью пинцета в том же положении, используют вольфрамовую иглу, чтобы облегчить эмбриона из открытых мембраны и положение его вентральной стороной вниз на слайде. Эмбриона должны придерживаться поли-лизин пальто.
      Филе эмбриона с заостренной вольфрамовой иглы. Аккуратно проколите, а затем оторвите тело стены вдоль спинной средней линии. С помощью иглы, надавите на стенки тела, так что он прилипает к слайду. Чтобы предотвратить повреждение стенки тела, нажмите стенки тела с кишку вставляли между ним и иглой. Затем с помощью иглы рвать через кишечник на его переднего и заднего концов и поднимите ее. При желании, дополнительные эмбрионы могут быть переданы в тот же слайд, devitellinised и филе, стараясь не повредить другие эмбрионы уже наслайда.
   2. Пальто 24 х 60 мм покровным гептаном клея (см. Таблицу 1), создав небольшую каплю клея в центре слайда и его распространение с 18 х 18 мм покровным в очень тонкую пленку. Поместите покровное на предметное стекло микроскопа и сделать рамки односторонней клейкой лентой по краям. Срежьте избыток агара из блока проведении ряда 10 эмбрионов, осторожно прикасаться к эмбрионы с покровным покровное гептан клея. Они теперь должны придерживаться покровное с брюшной стороны вниз. Добавить щедрое количество PBS, чтобы покрыть эмбрионов (рис. 2, шаги 4-6).
      Проникнуть желточной мембраны со стеклянной или вольфрамовой иглой на спинной стороне каждого эмбриона вблизи ее заднего конца. Вскройте мембраны вдоль спинной средней линии и перетащите эмбриона из оболочки. Orient эмбриона вентральной стороной вниз в другом месте на гептана подложке клеем и филе, используя тот же метод, описанный в 2.3A) (см.Рисунок 2, шаги 7-8). Так как несколько эмбрионов будут филе на одном слайде, это полезно быть либо очень точным с их ориентацией или сделать рисунок их ориентации на слайде.
4. После филе, эмбрионы могут быть легко зафиксированы в течение 10-15 мин в 7,4% формальдегида в PBS, затем 4 промывками в PBS. Экстремальный необходимо позаботиться, чтобы не довести эмбрион в контакт с поверхностью раствора в ходе этого процесса, так как силы поверхностного натяжения уничтожит эмбрион. Это до фиксации шаг не является строго обязательным, но полезно для предотвращения сокращения мышц стенки тела в конце эмбрионов на стадии и помочь стабилизировать эмбриональных тканей на молодых стадиях. Имейте в виду, что фиксация делает ткани эмбриона более непрозрачной и так несколько компромиссов качества изображения при DIC наблюдения.

3. Заполнение инъекций Микропипетки

Половина заполнения 0,5 мл Eppendorf пробирке с0,1% раствор красителя carbocynanine DiI (Molecular Probes, Eugene, OR) в 100% этанола (не забудьте использовать "сухой" абсолютного этанола, чтобы избежать DiI осадков). Сделать узкое отверстие в крышке трубки и вставить тупым концом микропипетки через отверстие в крышке. Разрешить DiI подняться вверх по нити, по крайней мере 5 мин. (Всегда закрывайте отверстия в крышке, когда он не заполнение микропипетки, чтобы избежать испарения этанола).

Оборудование, необходимое для инъекций красителя нейрона (рис. 3).

Микроскоп. Фиксированным столик микроскопа должен быть использован для инъекции нейрона краситель, чтобы избежать вертикального перемещения эмбриона во время фокусировки. Любое такое движение будет вытеснять пипетки после того, как вступил в контакт с эмбрионом. Мы нашли, как Zeiss Axioskop FS и Olympus AX50/BX50 фиксированных моделей этапе хорошо подходит для этой цели. Микроскоп должен быть оснащен проходящем свете DIC оптика для визуализации NeurДополнения перед окрашиванием. Микроскоп также должна быть вертикальной, а не перевернутая модель. С прямого микроскопа, кончик микропипетки находится на той же стороне эмбриона, как просмотр цели, в то время как с помощью инвертированного микроскопа два находятся на противоположных сторонах эмбриона. Последний расположение ставит под угрозу качество DIC оптики. Микроскоп должен быть создан для флуоресцентной микроскопии, с подходящим набором фильтров для наблюдения DiI. С DiI имеет сравнительно широкий спектр с возбуждения и испускания максимумами при 549 и 565 нм многие наборы фильтров в этом диапазоне будет работать, например, те, за 568 Alexa, Cy3, родамина, Texas Red или TRITC. Хотя это удобно, чтобы соответствовать электронным управлением затвора на пути флуоресценции источник света, чтобы позволить работу затвора без контакта рук с микроскопом, мы также эффективно помечены на установку которой было оснащено только ручным затвором. Наконец, большое увеличение, высокое численное apertuповторное погружение в воду цели необходимы для наблюдения во время инъекции. Эта цель должна быть предназначена для использования без покровное. Мы успешно использовали Zeiss Achroplan 100x/1.0W, Olympus FL LUMPlan 100x/1.0W, и Olympus FL LUMPlan / IR 60x/0.9 W цели.

Микроманипулятора требуется для размещения и перемещения микропипетки во время инъекции нейрона красителя. Мы использовали оба микроманипулятора Leica и стадии монтажа Narashige 3-осевых гидравлических микроманипулятора.

Внутриклеточных усилитель постоянного тока, с возможностью для инжекции тока, требуется для iontophoretic инъекции DiI из микропипетки.

4. Порядок краска инъекций

1. Поместите слайды с установленными эмбрион (ы) на этапе введения микроскопа (рис. 3). Используйте 10x цель, чтобы найти эмбриона и привести его в центр поля зрения.
2. SwING высокую цель власти в просмотре положение и принести эмбриона в фокусе. Найдите ячейку проценты по ОПК оптики (или с помощью флуоресценции, если клетки-мишени выражает GFP) и приведения его в центр поля зрения. Убедитесь, что в поле диафрагмой микроскопа открыл только на краю поля зрения, а не за его пределами. Узкого пучка освещения будет способствовать позиционированию микропипетки (см. п. 4.4). Поднимите цели, пока она не как можно выше над эмбрионом, оставаясь в контакте с Ringer / PBS решение.
3. Поместите электрод для ванны усилитель постоянного тока в PBS подальше от эмбриона и пути микропипетки.
4. Вставьте инъекции микропипетки в держатель, который был заполнен с 0,1 М раствора LiCl. Прикрепите держатель для микропипетки микроманипулятора. Использование микроманипулятора грубого контроля, довести микропипетки в пространство между кончиком цели и эмбрионов.Убедитесь, что он находится значительно выше уровня эмбриона. Из-за короткого рабочего расстояния высокую цель власти, микропипетки должны быть проведены под небольшим углом для того, чтобы привести его в фокус (см. Рисунок 3). Вам нужно будет установить соответствующий угол путем проб и ошибок, в первую очередь. Если угол слишком крутой, вы не сможете получить микропипетки чаевые в центре внимания. Если он слишком мелкий, вал микропипетки будет фол против стены плотины проведения купания решение на месте.
5. Центр кончике микропипетки в поле зрения. Для достижения этой цели, принесите свой глаз на уровне зародыша и переместить микропипетки взад и вперед по Y-оси микроскопа. Когда его кончик пересекает путь света, вы увидите яркое отражение световых лучей от него. Перемещение кончика микропипетки вперед в X-оси, так что это выбросы светового пучка. Это будет легче найти микропипетки в небольшихПоле зрения высокую цель власти, если вы ищете его валу, а не его кончик. Теперь посмотрите в микроскоп окуляры и постепенно снижать высокую цель власти до вала микропипетки вступает в фокусе. Перемещение микропипетки вперед и назад в Y-ось с микроманипулятора управления помогает найти, так как она постепенно приходит в фокус. Когда вал находится в фокусе, переместить микропипетки в X-оси, пока его кончик лежит в центре поля зрения. На данном этапе кончике микропипетки должны быть значительно выше уровня эмбриона. Переключить на флуоресценцию освещения и изучить наконечник для проверки утечки DiI. Отрегулируйте постоянного тока, чтобы предотвратить любой кристалл DiI от формирования на конце.
6. Использование микроманипулятора управления, снизить микропипетки в Z-оси. Принесите его обратно в центр внимания с управления фокус микроскопа. Постепенное снижение микропипетки вниз к эмбриона на этом пути. Первоначально, вы можете сделать это с грубымиZ-оси контроля микроманипулятора и микроскоп. Однако, как эмбрион вступает в фокусе вам нужно перейти к тонкой ручки управления.
7. Когда поверхность эмбриона происходит в центре внимания, перемещение кончика микропипетки к краю поля зрения, в направлении микроманипулятора. Фокус на ячейку вводится и убедитесь, что она лежит в центре поля зрения. Переориентация на кончике микропипетки и переместить его в Y-ось, пока он находится на том же уровне в Y-оси клетки. Перемещение кончика микропипетки к ячейке в X-оси, как вы опустите его в Z-оси. При использовании микроманипулятора Leica, вы, вероятно, обнаружите, что столик микроскопа контролирует дать вам более тонкий контроль движений в X-оси, чем микроманипулятора управления, поэтому переключиться на этапе контроля, как кончик приближается к клетке.
8. Принесите микропипетки наконечник в контакт с клеткой и сделать депрессии на его поверхности. Пройдите несколько nanoamps из depolariziнг текущем течение нескольких секунд. Вы должны увидеть небольшой кристалл DiI формирования на клетку. Чтобы подтвердить, что клетки были помечены, кратко открыть затвор, чтобы осветить эмбриона с флуоресцентным светом, а затем вернитесь в ОПК. Если тело клетки интерес проявляет признаки маркировки, применяется текущая в течение нескольких секунд. Выключите ток и быстро вытащить зародыш от микропипетки в X-оси с помощью контроля столик микроскопа. Затем снять микропипетки из раствора. Если нет маркировки DiI очевидно, микропипетки может быть заблокирован и требует замены с новым микропипетки. Вы можете обнаружить, что кончике микропипетки была зацепил других тканей на пути к ячейке интерес и эта ткань окрашивается, а не в клетке. В этом случае, попробуйте снятия микропипетки немного, и вновь приблизиться к клетке. Это может быть необходимо заменить микропипетки и попробуйте снова.

9. При желании, несколько ячеек может быть индивидуальносоюз помечены в том же эмбрион.
10. Удалите большинство из раствора в камеры впрыска, а затем исправить эмбрионов путем добавления 7,4% формальдегида / PBS в течение 10 мин, затем 4 промывок PBS. Эмбрион затем оставляют при комнатной температуре в течение по крайней мере 4 часа (или на ночь при 4 ° С) в темном, влажной камере (во избежание обесцвечивания или сухой падения), чтобы DiI, чтобы рассеять по всему нейронных процессов. На данном этапе, DiI-меченых клеток может быть либо photoconverted или просматривать непосредственно в конфокальной микроскопии.

5. Фотопреобразования на исследование с использованием DIC оптики

Принцип фотопреобразования является (фото-) окисления DAB от дневного света, испускаемого окрашенные клетки при освещении с соответствующей длиной волны. Это означает, яркие клетки photoconverted в более короткие сроки по сравнению с слабо окрашенных клеток. Если несколько ячейки, обозначенные в одном образце слишком сильно отличаются по своей яркости это может привести к difficulties в photoconverting все они в той же качества (см. рисунок 4C): в этом случае, возможно, придется принять решение о компромиссе между пренебрегая слабыми клеток (с использованием коротких освещении) или признания того, что ярче клетки начинают набухать (используя больше освещения) . Если все клетки слишком слабо обозначенный (таким образом, нуждающиеся очень долгое освещение), фон вызванных эндогенными пероксидазы может стать проблемой. С DAB является токсичным следует использовать с осторожностью. Отходы могут «отключить» с 7% хлора отбеливания.

1. Фотопреобразования должна проводиться для каждого эмбриона индивидуально. В случае, когда только один эмбрион вводится на слайд, решение PBS покрытие эмбриона заменяется решением DAB (3 мг DAB / мл Трис-буфер), слайд помещается на флуоресцентного микроскопа и заполненные ячейки рассматривается с 100x цели. (С использованием прямой микроскоп цели погружается в раствор DAB и должны быть очищены несколько раз водой после фотопреобразования рrocedure закончена, этого можно избежать, если инвертированный микроскоп используется). Cy3 набор фильтров и 100 Вт лампе ртуть используется и клетка подвергается красной длине волны возбуждения до коричневого продукта реакции DAB становится очевидным в меченых нейронов (периодически проверять путем перехода на яркое освещение поля). Время, необходимое для оптимального окрашивания DAB является переменной величиной, но требует воздействия возбуждающего света за сцену, где флуоресценция полностью исчезла. После фотопреобразования завершена, мыть подготовки несколько раз PBS. Заменить PBS с каплей 70% глицерина, соскрести с силиконовыми лезвие скальпеля, замените кольцо вазелином и добавить покровное.
2. Когда несколько эмбрионов были заполнены на одном слайде, передавать каждый эмбрион небольшую каплю PBS на отдельном 24 х 60 мм покровным с вентральной стороне эмбриона, стоящих перед стеклом. Поместите рамках клейкой лентой вокруг каждого эмбриона создать хорошо и охватывают подготовку с PBS. Держите слайдах во влажной камере до фотопреобразования, чтобы предотвратить их от высыхания. Биржи PBS покрытие эмбриона с решением DAB. Немедленно поместить слайд на инвертированный микроскоп оснащен 100 Вт лампа Hg и использовать Cy3 набор фильтров для возбуждения DiI, используя топор 50 целей. После фотопреобразования, передача эмбриона к новому стекло в каплю 70% глицерина, добавить покровное и печать с лаком для ногтей.

6. Экспертиза с помощью конфокальной микроскопии

1. После шаг 4.10, передача эмбрионов небольшую каплю PBS на свежем 24 х 60 мм покровным. Мы добиваемся оптимального оптики за счет установки плоского эмбрионов с дорсальной стороны к покровным (оставив только небольшое количество PBS между покровным и эмбрионов).
2. Поместите рамках клейкой лентой вокруг эмбриона и увеличить падение PBS, чтобы заполнить кадр, когда покрытый слайд. Поместите слайды на нее внимательно и закрепить его лаком для ногтей. Заполненные нейроны должны быть экзаменаINED на конфокальной (или флуоресценции) микроскоп как можно скорее.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

На рисунке 4 показаны типичные результаты технику, мы опишем здесь. Рисунке 4а приведен пример DiI заполнены одной интернейронов, который был чисто photoconverted. Это хорошо демонстрирует степень детализации этих препаратов предложение. При осмотре под DIC оптики пространств?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Одно из главных преимуществ Drosophila в качестве модельной системы является то, что она позволяет анализ развития и функционирования на уровне отдельных клеток. Это особенно полезно в отношении нервной системы, где разнообразие типов клеток является исключительно высоким и функции ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название Реагенты / Материал	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
			РЕАГЕНТЫ
DAB	Sigma-Aldrich	D-5905	2-3 мг / мл в 100 мМ Трис-HCl, рН 7,4
DiI	Invitrogen / Molecular Probes	D-282	1 мг / мл в этаноле
Формальдегид	Merck Millipore		7,4% в PBS
Глицерин	Рот	3783	70% в PBS
Гептан Клей	Beiersdorf AG	Виолончель 31-39-30 *	разбавлять ок. 1 к 1 с н-гептан
PBS			1x
TRIS	Рот	4855
Vectashield	Vector Laboratories	H1000
			ОБОРУДОВАНИЕ
Конфокальный микроскоп	Leica	TCS SP2	Для просмотра и документирования маркировок флуоресценции
DC -mplifier	Драган корпорации	Cornerstone ION-100	Для выполнения маркировок
Покровные	Менцель	BB018018A1	18 х 18 мм
Покровные	Менцель	BB024060A1	24 х 60 мм
Препаровальная лупа	Leica	MZ8	подготовить и disect эмбрионов
Плоский Капилляры	Хильгенберг		Наружный диаметр 1 мм, стеклянная толщина 0,1 мм
Инъекции Капилляры	Наука продукты	GB 100 TF 8P
Микроманипулятор R	Leica		Для выполнения маркировок
Модель P-97	Sutter Instruments		тянуть капилляров
Объект Слайды	Marienfeld Улучшенный	1000000
Научно микроскоп	Zeiss	Axioskop 2 мот	Для просмотра маркировок после фотопреобразования
Научно микроскоп	Олимп	BX50	Для выполнения маркировок
Sony MC3255 видеокамеры	Sony / AVT Роге	Sony MC3255	для записи маркировок после фотопреобразования